骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合雌激素治療宮腔粘連的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　 宮腔粘連(intrauterine adhesions，IUA)又稱Asherman綜合征，1894年由Fritsch最先描述，1948年Asherman首次詳細(xì)報(bào)道，將其定義為:由于子宮內(nèi)膜損傷導(dǎo)致子宮內(nèi)膜纖維化，宮腔部分或全部閉塞，繼而引起月經(jīng)過少、閉經(jīng)、不孕或反復(fù)流產(chǎn)。在繼發(fā)性閉經(jīng)患者中IUA發(fā)病率占5.1％，女性不孕癥中IUA發(fā)病率占4.8％，而流產(chǎn)后刮宮的IUA發(fā)病率高達(dá)37.6％。近年來由于頻繁的宮

2、腔操作及宮腔鏡手術(shù)的普及，IUA的發(fā)病率和檢出率逐漸上升，而且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢，已成為女性繼發(fā)不孕的第二大病因。盡管臨床醫(yī)生不斷尋求新的治療方案，IUA的治愈率和妊娠率仍無明顯改善，且復(fù)發(fā)率較高（輕度IUA患者治療后復(fù)發(fā)率為33.3％，重度IUA患者治療后復(fù)發(fā)率更是高達(dá)66.7％），由此引起的不孕以及反復(fù)流產(chǎn)、早產(chǎn)、前置胎盤、胎盤粘連或植入等產(chǎn)科并發(fā)癥嚴(yán)重威脅著女性的生殖健康。
　　 IUA的防治多年來一直困擾著臨床醫(yī)生，其

3、高發(fā)病率及其所導(dǎo)致的女性生育功能損害已成為臨床上亟待解決的問題。目前臨床上針對IUA的治療旨在恢復(fù)宮腔形態(tài)，防止粘連復(fù)發(fā)，促進(jìn)損傷子宮內(nèi)膜修復(fù)再生，恢復(fù)正常生育功能。治療IUA的3個(gè)重要步驟是宮腔鏡下宮腔粘連分離術(shù)、術(shù)中放置宮內(nèi)節(jié)育器以及術(shù)后應(yīng)用雌孕激素，但存在著治療周期長、治愈率低下、粘連易復(fù)發(fā)、妊娠率低、大劑量雌激素應(yīng)用增加患者乳腺和子宮內(nèi)膜腫瘤風(fēng)險(xiǎn)等問題，而且嚴(yán)重的肌性或結(jié)締組織性IUA中子宮內(nèi)膜基底層已被破壞，對雌孕激素反應(yīng)較差

4、。
　　 迄今為止，國內(nèi)外學(xué)者對IUA的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量研究，一致認(rèn)為子宮內(nèi)膜修復(fù)障礙可能是IUA形成的主要機(jī)制。如流產(chǎn)后刮宮或其它宮腔操作后，由于一些病理因素，使子宮內(nèi)膜修復(fù)發(fā)生障礙，結(jié)果導(dǎo)致瘢痕形成、粘連發(fā)生。近年來，國內(nèi)外學(xué)者相繼用不同研究方法證實(shí)了子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的存在，為與子宮內(nèi)膜增生或修復(fù)異常相關(guān)的各種婦科疾病發(fā)病機(jī)制提供了新見解，如:子宮內(nèi)膜癌和子宮內(nèi)膜異位癥等，可能與子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的異常分化和增殖有關(guān);而不明原因

5、的子宮內(nèi)膜薄和宮腔粘連可能與子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的減少或缺失有關(guān)。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一類具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，是目前組織工程中理想的干細(xì)胞來源。BMSCs因具有自我更新、多潛能分化、取材方便、能夠自體移植避免免疫排斥和倫理問題等特點(diǎn)，已引起了廣泛的關(guān)注，尤其是在修復(fù)損傷組織方面。移植BMSCs可用于治療多種損傷性疾病，如心肌梗塞、擴(kuò)張性

6、心肌病造成的心肌損傷;修復(fù)急性腎損傷引起的內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管細(xì)胞，改善腎功能;亦可修復(fù)骨、軟骨和肌腱缺損。但BMSCs在IUA所致的子宮內(nèi)膜損傷中的治療潛能未見相關(guān)報(bào)道，如果BMSCs能成功應(yīng)用于IUA的治療，修復(fù)損傷的子宮內(nèi)膜，必將為IUA的治療開辟新的領(lǐng)域。
　　 因此，本研究在建立BMSCs體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增體系的基礎(chǔ)上，對BMSCs進(jìn)行熒光標(biāo)記。檢測BMSCs在體外一定培養(yǎng)條件下向子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和/或間質(zhì)細(xì)胞分化的能力

7、及其可能的機(jī)制。進(jìn)一步建立新西蘭大白兔宮腔粘連動物模型，將體外擴(kuò)增的兔BMSCs，標(biāo)記后直接注射至雙側(cè)子宮肌壁間，觀察BMSCs在子宮組織的存活和遷移，觀察移植后子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)的變化，檢測子宮組織和子宮內(nèi)膜腺上皮特異性標(biāo)記物基因水平和蛋白表達(dá)的改變。初步研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植和雌激素治療在修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷中可能的作用及機(jī)制，為探索新的宮腔粘連的治療方向提供理論依據(jù)。
　　 第一章新西蘭大白兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)、鑒

8、定及標(biāo)記
　　 目的:
　　 建立幼年雌性新西蘭大白兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)體外分離，培養(yǎng)方法，研究其生物學(xué)特性和表型特征;用熒光染料對BMSCs進(jìn)行標(biāo)記，并觀察其對細(xì)胞形態(tài)，凋亡和增殖活性等生物學(xué)特征的影響。
　　 方法:
　　 1.在無菌條件下取出兔股骨和脛骨，采用全骨髓貼壁細(xì)胞分離法分離純化兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSCs。待細(xì)胞鋪滿瓶底

9、的80％以上，按照1∶2～1∶3傳代培養(yǎng)。
　　 2.采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD44、CD45和CD90的表達(dá)，進(jìn)行鑒定。
　　 3.采用PKH26對BMSCs進(jìn)行熒光標(biāo)記，檢測即時(shí)標(biāo)記率，通過Annexin-Ⅴ法檢測凋亡率、CCK-8法檢測BMSCs的增殖能力，繪制生長曲線，以明確PKH26標(biāo)記對體外培養(yǎng)BMSCs生物學(xué)特性的影響;通過流式細(xì)胞儀檢測PKH26標(biāo)記對兔BMSCs表面CD44、CD45和CD90表達(dá)的

10、影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.體外原代培養(yǎng)的BMSCs接種24h后部分貼壁，呈短小梭形或多角形;72h后絕大部分細(xì)胞貼壁，呈紡錘形或梭形，有散在分布的細(xì)胞集落形成;9～10d后可進(jìn)行首次傳代。傳3代以后，細(xì)胞形態(tài)趨于一致，呈纖維細(xì)胞樣貼壁生長。
　　 2.第3代BMSCs95％以上的細(xì)胞表達(dá)CD44和CD90，不表達(dá)CD45，證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 3.PKH26熒光染色的新西蘭大白兔B

11、MSCs即時(shí)標(biāo)記率為100％，標(biāo)記的細(xì)胞培養(yǎng)24h后，其形態(tài)與未標(biāo)記的BMSCs相比無明顯改變。PKH26標(biāo)記對兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力、凋亡率和細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)均無影響。
　　 結(jié)論:
　　 1.應(yīng)用全骨髓貼壁細(xì)胞分離法可以獲得純度較高、活性較好、表型穩(wěn)定均一的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 2.純化的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CD44和CD90，不表達(dá)CD45，可用于進(jìn)一步的體外誘導(dǎo)分化和體內(nèi)細(xì)胞移植研究。

12、>　　 3.PKH26標(biāo)記BMSCs方法簡單，標(biāo)記率高，可標(biāo)記大量細(xì)胞，且不影響B(tài)MSCs生物學(xué)特性，是追蹤BMSCs在體內(nèi)遷移，定植和分化的有效方法。
　　 第二章兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向子宮內(nèi)膜細(xì)胞方向分化的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:
　　 探討B(tài)MSCs在特定培養(yǎng)條件下向子宮內(nèi)膜細(xì)胞分化的能力及其可能的調(diào)控機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.制備子宮內(nèi)膜條件培養(yǎng)液(ECM)。
　　 2.實(shí)

13、驗(yàn)分組:①對照組:完全培養(yǎng)基;②ECM組:含20％ECM的完全培養(yǎng)基;③ECM+E-8組:含20％ECM和10-8mol/L17β-E2的完全培養(yǎng)基;④ECM+E-7組:含20％ECM和10-7mol/L17β-E2的完全培養(yǎng)基;⑤ECM+E-6組:含20％ECM和10-6mol/L17β-E2的完全培養(yǎng)基;⑥ECM+E-5組:含20％ECM和10-5mol/L17β-E2的完全培養(yǎng)基。
　　 3.抽提培養(yǎng)5天后細(xì)胞的mRNA，

14、采用熒光定量PCR(FQ-PCR)方法檢測分化細(xì)胞的CK18、ESR1和VIM基因水平。
　　 4.提取培養(yǎng)5天后細(xì)胞的蛋白，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)法檢測分化細(xì)胞的CK、VIM和ESR1蛋白含量;
　　 5.采用免疫熒光(IF)方法檢測培養(yǎng)5天后細(xì)胞表面上皮細(xì)胞標(biāo)記物CK蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.mRNA表達(dá)檢測結(jié)果顯示如下:
　　 (1)各組CK18 mRN

15、A相對表達(dá)量由高到低依次為ECM(7.64)、ECM+E-6(6.15)、ECM+E-7(5.62)、ECM+E-8(4.70)、ECM+E-5(1.49)和對照組(1.00)。各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，ECM+E-5組無顯著性差異，其余四組均有顯著性差異（PECM=0.000，PE-8=0.000，PE-7=0.000，PE-6=0.000，PE-5=0.168）。五個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間，ECM組分別與ECM+E-8(P=0.000)、ECM+E

16、-7(P=0.000)、ECM+E-6（P=0.001）和ECM+E-5組(P=0.000)相比均有顯著性差異。CK18基因表達(dá)和17β-雌二醇濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(rs=-0.615，P=0.000)。
　　 (2)各組ESR1 mRNA相對表達(dá)量由高到低依次為ECM(1.45)、ECM+E-6(1.38)、ECM+E-8(1.37)、ECM+E-7(1.36)、對照組(1.00)和ECM+E-5(0.73)。各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比

17、均有顯著性差異（P值均為0.000）。五個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間，ECM組分別與ECM+E-8(P=0.016)、ECM+E-7(P=0.006)、ECM+E-6（P=0.020）和ECM+E-5組(P=0.000)相比均有顯著性差異。ESR1相對表達(dá)量和17β-雌二醇濃度呈顯著負(fù)相關(guān)（rs=-0.729，P=0.000）。
　　 (3)各組VIM mRNA相對表達(dá)量均數(shù)由高到低依次為ECM(8.22)、ECM+E-5(7.29)、ECM+

18、E-7(6.15)、ECM+E-8(4.67)、ECM+E-6(2.33)和對照組(1.00)。各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均有顯著性差異（P值均為0.000）。五個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間，ECM組分別與ECM+E-8(P=0.000)、ECM+E-7(P=0.000)、ECM+E-6(P=0.000)和ECM+E-5組（P=0.000）相比均有顯著性差異。VIM基因水平和17β-雌二醇濃度呈顯著正相關(guān)（rs=0.611，P=0.000）。
　　

19、2.蛋白定量分析結(jié)果顯示如下:
　　 (1)各組CK蛋白相對表達(dá)量均數(shù)由高到低依次為ECM+E-5(0.92)、ECM+E-6(0.90)、ECM+E-7(0.88)、ECM(0.84)、ECM+E-8(0.58)和對照組(0.27)。各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均有顯著性差異（P值均為0.000）。五個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間，ECM組分別與ECM+E-8(P=0.000)、ECM+E-7（P=0.016）、ECM+E-6（P=0.004）和ECM

20、+E-5組(P=0.001)相比均有顯著性差異。CK蛋白相對表達(dá)量和17β-E2濃度呈顯著正相關(guān)（rs=0.725，P=0.000）。
　　 (2)各組ESR1蛋白相對表達(dá)量均數(shù)由高到低依次為ECM(0.75)、ECM+E-7(0.73)、ECM+E-5(0.35)、對照組(0.17)、ECM+E-8(0.14)和ECM+E-6(0.11)。各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，ECM+E-8組無顯著性差異，其余四組均有顯著性差異(PECM=0

21、.000，PE-8=0.101，PE-7=0.000，PE-6=0.002，PE-5=0.000)。五個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間，ECM組分別與ECM+E-8（P=0.001）、ECM+E-6（P=0.000）和ECM+E-5組（P=0.000）相比均有顯著性差異，和ECM+E-7(P=0.126)相比無顯著性差異。ESR1蛋白表達(dá)量和17β-雌二醇濃度無相關(guān)關(guān)系(rs=0.017，P=0.929)。
　　 (3)各組VIM蛋白相對表達(dá)量均數(shù)

22、由高到低依次為ECM+E-6(0.96)、ECM(0.92)、ECM+E-5(0.91)、ECM+E-8(0.85)、ECM+E-7(0.77)和對照組(0.14)。各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均有顯著性差異（P值均為0.000）。五個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間，ECM組分別與ECM+E-8(P=0.001)、ECM+E-7(P=0.000)和ECM+E-6(P=0.011)相比均有顯著性差異，和ECM+E-5組(P=0.517)相比無顯著性差異。VIM蛋白表

23、達(dá)量和17β-雌二醇濃度呈正相關(guān)關(guān)系（rs=0.382，P=0.037）。
　　 3.CK蛋白熒光結(jié)果顯示:細(xì)胞核為藍(lán)色熒光，CK蛋白陽性細(xì)胞胞漿為綠色熒光。對照組BMSCs細(xì)胞CK熒光染色陰性，各實(shí)驗(yàn)均可見CK陽性細(xì)胞。
　　 結(jié)論:
　　 1.子宮內(nèi)膜條件培養(yǎng)基和17β-雌二醇可以誘導(dǎo)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向子宮內(nèi)膜細(xì)胞方向分化，分化后的細(xì)胞CK18、VIM、和ESR1 mRNA水平增加，同時(shí)CK、VIM和ESR

24、1蛋白表達(dá)也增加，說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞同時(shí)向子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞方向分化。
　　 2.子宮內(nèi)膜條件培養(yǎng)基模擬的子宮內(nèi)膜微環(huán)境是誘導(dǎo)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向子宮內(nèi)膜腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素，而171β-雌二醇則能夠適當(dāng)調(diào)控這種分化效應(yīng)。
　　 第三章構(gòu)建成年雌性新西蘭大白兔宮腔粘連動物模型的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:
　　 根據(jù)IUA最主要的2個(gè)病因——?jiǎng)?chuàng)傷和感染，分別采用機(jī)械損傷、感染損傷以及機(jī)械和

25、感染雙重?fù)p傷的方法，擬探索建立新西蘭大白兔IUA動物模型的最佳方案。通過這個(gè)動物模型，為后續(xù)研究體內(nèi)移植BMSCs和應(yīng)用雌激素是否能治療IUA及其可能機(jī)制提供一個(gè)平臺。
　　 方法:
　　 1.采用12周齡雌性新西蘭大白兔建立宮腔粘連動物模型。建模前1天用10號醫(yī)用無菌手術(shù)線制備脂多糖(LPS)手術(shù)棉線。
　　 2.大白兔隨機(jī)分為4組，每組16只:①對照組;②機(jī)械損傷組:用子宮內(nèi)膜刮勺搔刮中上段子宮腔;③感染損傷

26、組:宮腔留置LPS手術(shù)棉線48h;④雙重?fù)p傷組（機(jī)械+感染損傷）:子宮內(nèi)膜刮勺搔刮中上段子宮腔后，宮腔留置LPS手術(shù)棉線48h。每組分別于建模后0h，24h，48h，72h和14d，28d處死2只大白兔（4個(gè)子宮），建模后7d處死4只大白兔（8個(gè)子宮），收集子宮組織。
　　 3.采用HE染色觀察子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)改變，計(jì)數(shù)建模一周后子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目。
　　 4.采用Masson染色觀察子宮內(nèi)膜纖維化情況，用圖像分析軟件分析建

27、模一周后子宮內(nèi)膜纖維化面積比。
　　 結(jié)果:
　　 1.建模后子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)改變:三種方法建模后0h，子宮內(nèi)膜均出現(xiàn)表面上皮脫落，子宮內(nèi)膜間質(zhì)裸露或變薄;間質(zhì)出血，中性粒細(xì)胞浸潤;毛細(xì)血管破裂、出血。建模后24～72 h，機(jī)械損傷組和感染損傷組子宮內(nèi)膜腺上皮均有不同程度再生，并可見新生腺體，間質(zhì)充血水腫逐漸減輕;雙重?fù)p傷組偶有扁平上皮細(xì)胞再生，而無腺體再生，間質(zhì)纖維化增生。建模后7d，機(jī)械損傷組和感染損傷組子宮內(nèi)膜腺上皮

28、基本恢復(fù)，上皮下出現(xiàn)腺體，間質(zhì)仍可見充血、水腫，淋巴細(xì)胞浸潤;雙重?fù)p傷組則可見宮腔粘連帶形成，腺體稀疏，間質(zhì)纖維化增生。
　　 2.建模后7d各組纖維化面積比分別為:對照組（27.50±3.34）、機(jī)械損傷組（40.52±3.72）、感染損傷組（37.80±3.79）和雙重?fù)p傷組（68.03±4.10）。各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，感染損傷組無顯著性差異，其余兩組均有顯著性差異（P機(jī)械=0.020，P感染=0.062，P雙重=0.00

29、0）。三種建模方法之間，雙重?fù)p傷組分別與機(jī)械損傷組組(P=0.000)和感染損傷組(P=0.000)相比均有顯著性差異。
　　 3.建模后7d腺體計(jì)數(shù)分別為:對照組（14.97±0.59）、機(jī)械損傷組（12.66±0.52）、感染損傷組（13.59±0.55）和雙重?fù)p傷組（4.19±0.48）。各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，感染損傷組無顯著性差異，其余兩組均有顯著性差異（P機(jī)械=0.005，P感染=0.081，P雙重=0.000）。三種

30、建模方法之間，雙重?fù)p傷組分別與機(jī)械損傷組（P=0.000）和感染損傷組(P=0.000)相比均有顯著性差異。
　　 4.機(jī)械損傷、感染損傷和雙重?fù)p傷的建模成功率分別為75％、62.5％和100％，三種方法的建模成功率有顯著差異，根據(jù)平均秩次進(jìn)一步推斷，雙重?fù)p傷法成功率最高，機(jī)械損傷法次之，感染損傷法最差（x2=11.000，P=0.012）。
　　 結(jié)論:
　　 雙重?fù)p傷法能引起兔子宮內(nèi)膜不可逆的損傷，形成瘢痕修

31、復(fù)及纖維化粘連帶，并且建模成功率高，是一種穩(wěn)定而有效的建立新西蘭大白兔IUA動物模型的方法。
　　 第四章骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合雌激素修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:
　　 在前期建立宮腔粘連動物模型基礎(chǔ)上，給予兔的雙側(cè)子宮移植BMSCs以及雌激素治療，探討其療效及機(jī)制，以期尋求IUA新的治療方法。
　　 方法:
　　 1.采用60只12周齡雌性新西蘭大白兔分為5組，每組各12只。①

32、對照組;②模型組;③移植組;④雌激素組;⑤聯(lián)合治療組，即BMSCs移植+雌激素治療組。
　　 2.采用雙重?fù)p傷法構(gòu)建動物模型。移植細(xì)胞為PKH26標(biāo)記的第2代BMSCs。每組分別于治療前(建模后1 w)，治療后1w、2w和4w時(shí)各處死3只大白兔（6個(gè)子宮），分別收集雙側(cè)子宮組織，同時(shí)收集耳緣靜脈血2ml。
　　 3.采取的兔耳緣靜脈血離心后留取血清用ELISA法檢測血清雌二醇。
　　 4.將收集的子宮組織分成4部

33、分檢測:
　　 (1) HE染色和Masson染色觀察子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化、腺體計(jì)數(shù)和纖維化面積比。
　　 (2)熒光顯微鏡觀察移植BMSCs在兔子宮、卵巢、宮頸和陰道中的定位。
　　 (3)提取子宮組織RNA，采用FQ-PCR法檢測CK18，VIM，ESR1和TFG-B1基因水平。
　　 (4)提取子宮組織蛋白，采用Western blot方法檢測CK和ESR1蛋白表達(dá)量。
　　 (5)采用IHC

34、方法檢測子宮內(nèi)膜組織中CK，VIM，ESR1和TFG-β1蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.HE染色結(jié)果顯示:雌激素組，移植組和聯(lián)合治療組從治療后1w開始，子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量均有不同程度的增加，新生腺體呈圓形或橢圓形。
　　 (1)治療前，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，均有顯著性差異（P值均為0.000）。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.159）和雌激素組（P=0.556）相比均無顯著性差異。
　　 (2)治療后

35、1 w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均有顯著性差異(P模型=0.000，P移植=0.001，P雌激素=0.001，P聯(lián)合=0.002)。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.482）和雌激素組（P=0.723）相比均無顯著性差異。
　　 (3)治療后2w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，聯(lián)合治療組無顯著性差異，其余三組均有顯著性差異（P模型=0.000，P移植=0.005，P雌激素=0.003，P聯(lián)合=0.124）。聯(lián)合治療組和移植組(P=0.079)

36、相比無顯著性差異，和雌激素組（P=0.049）相比有顯著性差異。
　　 (4)治療后4w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，移植組和雌激素組無顯著性差異，其余兩組均有顯著性差異（P模型=0.002，P移植=0.411，P雌激素=0.146，P聯(lián)合=0.028）。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.006）和雌激素組(P=0.002)相比均有顯著性差異。
　　 2.Masson染色結(jié)果顯示:各治療組子宮內(nèi)膜間質(zhì)藍(lán)染的膠原纖維不同程度的減少

37、，模型組在治療前后子宮內(nèi)膜間質(zhì)藍(lán)染的膠原纖維基本沒有減少。
　　 (1)治療前，各實(shí)驗(yàn)組纖維化面積比與對照組相比均有顯著性差異（P模型=0.002，P移植=0.002，P雌激素=0.002，P聯(lián)合=0.004）。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.629）和雌激素組(P=0.668)相比均無顯著性差異。
　　 (2)治療后1w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，聯(lián)合治療組無顯著性差異，其余三組均有顯著性差異（P模型=0.000，P移植=

38、0.014，P雌激素=0.013，P聯(lián)合=0.138）。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.205）和雌激素組(P=0.191)相比均無顯著性差異。
　　 (3)治療后2w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，移植組和聯(lián)合治療組無顯著性差異，其余兩組均有顯著性差異(P模型=0.000，P移植=0.918，P雌激素=0.002，P聯(lián)合=0.792)。聯(lián)合治療組和移植組(P=0.714)相比無顯著性差異，和雌激素組(P=0.001)相比有顯著性差異。

39、
　　 (4)治療后4w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，模型組有顯著性差異，其余三組均無顯著性差異(P模型=0.000，P移植=0.342，P雌激素=0.980，P聯(lián)合=0.670)。聯(lián)合治療組分別與移植組(P=0.589)和雌激素組(P=0.688)相比均無顯著性差異。
　　 3.熒光顯微鏡下觀察顯示:移植后7d， BMSCs移植組和聯(lián)合治療組可見到少量紅色熒光，持續(xù)至移植后21d，而其余各組以及相同時(shí)間點(diǎn)的宮頸、陰道和卵巢組

40、織均不能見到紅色熒光表達(dá)。與DAPI染核的藍(lán)色熒光視野對比觀察，紅色熒光主要分布在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞附近，子宮肌層內(nèi)見不到紅色熒光。
　　 4.血清雌二醇濃度分析顯示:
　　 (1)治療前各實(shí)驗(yàn)組和對照組血清雌二醇濃度無顯著差異（F=0.023，P=0.999），說明損傷子宮內(nèi)膜過程中未影響卵巢功能。
　　 (2)治療后1w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，雌激素組和聯(lián)合治療組有顯著性差異，其余兩組均無顯著性差異(P模型=

41、0.943，P移植=0.960，P雌激素=0.000，P聯(lián)合=0.000)。聯(lián)合治療組和移植組（P=0.000）相比有顯著性差異，和雌激素組(P=0.224)相比無顯著性差異。
　　 (3)治療后2w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，雌激素組和聯(lián)合治療組有顯著性差異，其余兩組均無顯著性差異(P模型=0.599，P移植=0.932，P雌激素=0.000，P聯(lián)合=0.000)。聯(lián)合治療組和移植組（P=0.000）相比有顯著性差異，和雌激素組（

42、P=0.939）相比無顯著性差異。
　　 (4)治療后4w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，聯(lián)合治療組有顯著性差異，其余三組均無顯著性差異（P模型=0.802，P移植=0.635，P雌激素=0.094，P聯(lián)合=0.001）。聯(lián)合治療組分別與移植組(P=0.041）和雌激素組（P=0.010）相比均有顯著性差異。
　　 5.mRNA表達(dá)水平分析結(jié)果顯示如下:
　　 (1)各組不同時(shí)間點(diǎn)子宮組織CK18 mRNA相對表達(dá)量分析

43、結(jié)果顯示:
　　 ①治療前，各實(shí)驗(yàn)組CK18 mRNA相對表達(dá)量與對照組相比均有顯著性差異（P模型=0.000，P移植=0.000，P雌激素=0.000，P聯(lián)合=0.000）。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.835）和雌激素組（P=0.776）相比均無顯著性差異。
　　 ②治療后1w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，模型組和移植組均有顯著性差異，其余兩組無顯著性差異（P模型=0.002，P移植=0.000，P雌激素=0.377，P

44、聯(lián)合=0.434）。聯(lián)合治療組和移植組（P=0.000）相比有顯著性差異，和雌激素組（P=0.915）相比無顯著性差異。
　　 ③治療后2 w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，移植組有顯著性差異，其余三組均無顯著性差異（P模型=0.197，P移植=0.008，P雌激素=0.062，P聯(lián)合=0.119）。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.180）和雌激素組（P=0.101）相比均無顯著性差異。
　　 ④治療后4 w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相

45、比，模型組和聯(lián)合治療組有顯著性差異，其余兩組均無顯著性差異(P模型=0.027，P移植=0.110，P雌激素=0.110，P聯(lián)合=0.007)。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.252）和雌激素組(P=0.351)相比均無顯著性差異。
　　 (2)各組不同時(shí)間點(diǎn)子宮組織VIM mRNA相對表達(dá)量分析結(jié)果顯示:
　　 ①治療前，各實(shí)驗(yàn)組VIM mRNA相對表達(dá)量與對照組相比均有顯著性差異(P模型=0.026，P移植=0.00

46、8，P雌激素=0.024，P聯(lián)合=0.010)。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.868）和雌激素組(P=0.630)相比均無顯著性差異。
　　 ②治療后1w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，模型組和聯(lián)合治療組均有顯著性差異，其余兩組均無顯著性差異（P模型=0.039，P移植=0.100，P雌激素=0.101，P聯(lián)合=0.021）。聯(lián)合治療組和移植組（P=0.764）相比無顯著性差異，和雌激素組（P=0.038）相比有顯著性差異。
　

47、　 ③治療后2w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，模型組和移植組均有顯著性差異，其余兩組均無顯著性差異(P模型=0.006，P移植=0.042，P雌激素=0.079，P聯(lián)合=0.199)。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.116）和雌激素組（P=0.095）相比均無顯著性差異。
　　 ④治療后4 w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，聯(lián)合治療組有顯著性差異，其余三組均無顯著性差異（P模型=1.000，P移植=0.136，P雌激素=0.057，P聯(lián)合=

48、0.042。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.151）和雌激素組（P=0.090）相比均無顯著性差異。
　　 (3)各組不同時(shí)間點(diǎn)子宮組織ESR1 mRNA相對表達(dá)量分析結(jié)果顯示:
　　 ①治療前，各實(shí)驗(yàn)組ESR1mRNA相對表達(dá)量與對照組相比均有顯著性差異（P模型=0.000，P移植=0.000，P雌激素=0.000，P聯(lián)合=0.010）。聯(lián)合治療組分別與移植組(P=0.340)和雌激素組（P=0.835）相比均無顯著性

49、差異。
　　 ②治療后1w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，移植組和聯(lián)合治療組有顯著性差異，其余兩組均無顯著性差異(P模型=0.993，P移植=0.014，P雌激素=0.214，P聯(lián)合=0.024)。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.023）和雌激素組（P=0.025）相比均有顯著性差異。
　　 ③治療后2w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，聯(lián)合治療組有顯著性差異，其余三組均無顯著性差異（P模型=0.971，P移植=1.000，P雌激素=0.

50、078，P聯(lián)合=0.019）。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.124）和雌激素組（P=0.251）相比均無顯著性差異。
　　 ④治療后4w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，聯(lián)合治療組有顯著性差異，其余三組均無顯著性差異（P模型=0.888，P移植=0.544，P雌激素=0.112，P聯(lián)合=0.002）。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.136）和雌激素組（P=0.463）相比均無顯著性差異。
　　 (4)各組不同時(shí)間點(diǎn)子宮組織TGF

51、-B1 mRNA相對表達(dá)量分析結(jié)果顯示:
　　 ①治療前，各實(shí)驗(yàn)組TGF-B1 mRNA相對表達(dá)量與對照組相比均有顯著性差異（P模型=0.000，P移植=0.000，P雌激素=0.000，P聯(lián)合=0.000）。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.467）和雌激素組（P=0.987）相比均無顯著性差異。
　　 ②治療后1w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，雌激素組無顯著性差異，其余三組均有顯著性差異（P模型=0.009，P移植=0.03

52、2，P雌激素=0.132，P聯(lián)合=0.014）。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.014）和雌激素組（P=0.013）相比均有顯著性差異。
　　 ③治療后2w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，移植組無顯著性差異，其余三組均有顯著性差異（P模型=0.006，P移植=0.079，P雌激素=0.001，P聯(lián)合=0.000）。聯(lián)合治療組和移植組（P=0.009）相比有顯著性差異，和雌激素組（P=0.936）相比無顯著性差異。
　　 ④治療后

53、4w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，雌激素組和聯(lián)合治療組均有顯著性差異，其余兩組無顯著性差異（P模型=0.214，P移植=0.830，P雌激素=0.000，P聯(lián)合=0.000）。聯(lián)合治療組和移植組（P=0.042）相比有顯著性差異，和雌激素組（P=0.058）相比無顯著性差異。
　　 6.子宮組織蛋白定量檢測結(jié)果分析顯示:
　　 (1)各組不同時(shí)間點(diǎn)子宮組織CK蛋白相對表達(dá)量分析結(jié)果顯示:
　　 ①治療前，各實(shí)驗(yàn)組子宮組

54、織CK蛋白相對表達(dá)量與對照組相比均有顯著性差異（P值均為0.000）。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.755）和雌激素組(P=0.646)相比均無顯著性差異。
　　 ②治療后1w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均有顯著性差異（P值均為0.000）。聯(lián)合治療組分別與移植組(P=0.851)和雌激素組（P=0.329）相比均無顯著性差異。
　　 ③治療后2w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均有顯著性差異（P值均為0.000）。聯(lián)合治療組分別與移

55、植組(P=0.002)和雌激素組（P=0.002）相比均有顯著性差異。
　　 ④治療后4w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均有顯著性差異（P值均為0.000）。聯(lián)合治療組和移植組（P=0.300）相比無顯著性差異，和雌激素組（P=0.001）相比有顯著性差異。
　　 (2)各組不同時(shí)間點(diǎn)子宮組織ESR1蛋白相對表達(dá)量分析結(jié)果顯示:
　　 ①治療前，各實(shí)驗(yàn)組子宮組織ESR1蛋白相對表達(dá)量與對照組相比均有顯著性差異（P值均為0

56、.000）。三個(gè)治療組之間，聯(lián)合治療組分別與移植組(P=0.616)和雌激素組(P=0.350)相比均無顯著性差異。
　　 ②治療后1w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均有顯著性差異（P模型=0.000，P移植=0.000，P雌激素=0.000，P聯(lián)合=0.002）。三個(gè)治療組之間，聯(lián)合治療組分別與移植組(P=0.000)和雌激素組(P=0.000)相比均有顯著性差異。
　　 ③治療后2w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均有顯著性差異（P模

57、型=0.000，P移植=0.000，P雌激素=0.000，P聯(lián)合=0.043）。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.000）和雌激素組(P=0.000)相比均有顯著性差異。
　　 ④治療后4w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，聯(lián)合治療組無顯著性差異，其余三組均有顯著性差異(P模型=0.000，P移植=0.000，P雌激素=0.000，P聯(lián)合=0.248)。聯(lián)合治療組分別與移植組(P=0.000)和雌激素組(P=0.000)相比均有顯著性差異。

58、
　　 7.IHC檢測結(jié)果顯示:
　　 (1)CK蛋白在子宮內(nèi)膜腺上皮的陽性著色為細(xì)胞膜呈棕黃色或棕褐色。
　　 ①治療前，整體比較各組無顯著性差異（F=0.443，P=0.775）。
　　 ②治療后1w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，雌激素組有顯著性差異，其余三組均無顯著性差異（P模型=0.990，P移植=0.941，P雌激素=0.050，P聯(lián)合=0.819）。聯(lián)合治療組分別與移植組(P=0.961)和雌激素組

59、（P=0.108）相比無顯著性差異。
　　 ③治療后2w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，移植組和雌激素組有顯著性差異，其余兩組均無顯著性差異（P模型=0.566，P移植=0.022，P雌激素=0.026，P聯(lián)合=0.397）。三個(gè)治療組之間，聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.098）和雌激素組（P=0.114）相比均無顯著性差異。
　　 ④治療后4w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均無顯著性差異（P模型=0.635，P移植=0.325，P雌

60、激素=0.696，P聯(lián)合=0.999）。聯(lián)合治療組和移植組（P=0.020）相比有顯著性差異，和雌激素組（P=0.080）相比無顯著性差異。
　　 (2) VIM蛋白在正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞幾乎不著色，或細(xì)胞膜著色，呈棕黃色;在其余4組的腺上皮陽性著色為細(xì)胞膜或細(xì)胞漿呈棕黃色或棕褐色。
　　 ①治療前，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，雌激素組和聯(lián)合治療組有顯著性差異，其余兩組均無顯著性差異（P模型=0.093，P移植=0.124，

61、P雌激素=0.024，P聯(lián)合=0.030）。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=1.000）和雌激素組(P=1.000)相比無顯著性差異。
　　 ②治療后1w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，模型組和移植組有顯著性差異，其余兩組均無顯著性差異（P模型=0.048，P移植=0.001，P雌激素=0.998，P聯(lián)合=0.321）。聯(lián)合治療組和移植組（P=0.012）相比有顯著性差異，和雌激素組（P=0.298）相比無顯著性差異。
　　 ③治療

62、后2w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均無顯著性差異（P模型=0.232，P移植=0.563，P雌激素=0.072，P聯(lián)合=0.545）。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.975）和雌激素組（P=0.063）相比均無顯著性差異。
　　 ④治療后4w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，模型組有顯著性差異，其余三組均無顯著性差異（P模型=0.038，P移植=0.931，P雌激素=0.717，P聯(lián)合=0.988）。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.724）和雌

63、激素組（P=0.698）相比均無顯著性差異。
　　 (3) ESR1蛋白在正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞核著色，呈棕黃色或黃褐色;在其余4組的腺上皮陽性著色為細(xì)胞核或細(xì)胞漿呈棕黃色或棕褐色，陰性為在腺上皮細(xì)胞不著色。
　　 ①治療前，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均有顯著性差異（P模型=0.000，P移植=0.000，P雌激素=0.000，P聯(lián)合=0.000）。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.224）和雌激素組（P=0.932）相比均無顯

64、著性差異。
　　 ②治療后1w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，模型組有顯著性差異，其余三組均無顯著性差異（P模型=0.037，P移植=0.597，P雌激素=0.851，P聯(lián)合=0.659）。三個(gè)治療組之間，聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.992）和雌激素組(P=0.307)相比均無顯著性差異。
　　 ③治療后2w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均有顯著性差異（P模型=0.000，P移植=0.003，P雌激素=0.001，P聯(lián)合=0.050

65、）。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.115）和雌激素組（P=0.060）相比均無顯著性差異。
　　 ④治療后4w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，模型組和雌激素組有顯著性差異，其余兩組均無顯著性差異（P模型=0.002，P移植=0.535，P雌激素=0.007，P聯(lián)合=0.488）。聯(lián)合治療組和移植組（P=0.203）相比無顯著性差異，和雌激素組（P=0.002）相比有顯著性差異。
　　 (4) TGF-β1蛋白在正常子宮內(nèi)膜腺上

66、皮細(xì)胞不著色，或胞漿著色，呈棕黃色;在腺上皮陽性著色為細(xì)胞核或細(xì)胞漿呈棕黃色或棕褐色。
　　 ①治療前，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均有顯著性差異（P值均為0.000）。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.467）和雌激素組（P=0.987）相比均無顯著性差異。
　　 ②治療后1w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均無顯著性差異（P模型=0.098，P移植=0.550，P雌激素=0.075，P聯(lián)合=0.138）。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.

67、996）和雌激素組（P=0.093）相比均無顯著性差異。
　　 ③治療后2w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，雌激素組有顯著性差異，其余三組均無顯著性差異（P模型=0.133，P移植=1.000，P雌激素=0.023，P聯(lián)合=0.190）。聯(lián)合治療組和移植組（P=0.190）相比無顯著性差異，和雌激素組（P=0.014）相比有顯著性差異。
　　 ④治療后4w，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均無顯著性差異（P模型=0.929，P移植=0.38

68、3，P雌激素=0.076，P聯(lián)合=0.698）。聯(lián)合治療組分別與移植組（P=0.866）和雌激素組（P=0.073）相比均無顯著性差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以在損傷的子宮內(nèi)膜中存活、遷移，可能作為外源性的干細(xì)胞來源修復(fù)損傷的子宮內(nèi)膜。
　　 2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療損傷的子宮內(nèi)膜，可以從形態(tài)學(xué)上觀察到損傷的子宮內(nèi)膜基本修復(fù)，即子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量增加，而間質(zhì)纖維化面積減少，但子宮組織ESR

69、1蛋白表達(dá)量和子宮內(nèi)膜腺上皮CK蛋白的表達(dá)與正常子宮內(nèi)膜仍存在差異，說明子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的雌激素受體表達(dá)仍未完全恢復(fù)，腺上皮細(xì)胞的表型并未完全修復(fù)。
　　 3.用雌激素治療損傷的子宮內(nèi)膜后，子宮內(nèi)膜的腺體數(shù)量和間質(zhì)纖維化的面積也恢復(fù)到正常子宮內(nèi)膜水平，但子宮組織ESR1蛋白表達(dá)量仍未恢復(fù)到正常水平，子宮內(nèi)膜腺上皮的ESR1蛋白表達(dá)也低于正常水平，說明子宮內(nèi)膜腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞的雌激素表達(dá)均未完全修復(fù)。
　　 4.用骨髓間充

70、質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合雌激素治療損傷的子宮內(nèi)膜后，再生的子宮內(nèi)膜從形態(tài)學(xué)和細(xì)胞表型方面均和正常的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞類似，說明聯(lián)合治療的方法可能可以完全修復(fù)損傷的子宮內(nèi)膜。
　　 全文小結(jié):
　　 1.應(yīng)用全骨髓貼壁細(xì)胞分離法可以獲得純度較高的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。PKH26標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞方法簡單，標(biāo)記率高，是追蹤骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)遷移，定植和分化的有效方法。
　　 2.子宮內(nèi)膜條件培養(yǎng)基和不同濃度17β-雌二醇可以

71、誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向子宮內(nèi)膜方向分化。子宮內(nèi)膜條件培養(yǎng)基模擬的子宮內(nèi)膜微環(huán)境是誘導(dǎo)BMSCs向子宮內(nèi)膜分化的關(guān)鍵因素，而雌激素則能夠適當(dāng)調(diào)控這種分化效應(yīng)和分化方向。
　　 3.機(jī)械和感染的雙重?fù)p傷法可以引起兔子宮內(nèi)膜不可逆的損傷，是一種穩(wěn)定而有效的建立新西蘭大白兔宮腔粘連動物模型的方法。
　　 4.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合雌激素治療宮腔粘連模型后，子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目明顯增加，子宮間質(zhì)纖維化程度恢復(fù)到正常水平。修復(fù)后的子宮