中國腦膜炎奈瑟菌MLVA方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、研究目的：
　　1、篩選適合中國N.m的VNTR位點(diǎn)，建立我國N.m的MLVA方法。
　　2、初步建立我國N.mMLVA數(shù)據(jù)庫，并完善MLST數(shù)據(jù)庫。
　　3、對我國N.m進(jìn)行MLVA分型，結(jié)合菌株現(xiàn)有的病原學(xué)及流行病學(xué)特征，建立不同MLVA分析方案，比較其優(yōu)勢及局限性，明確其應(yīng)用范圍及價(jià)值。
　　4、分析中國C群，特別是ST-4821 complex N.m的系統(tǒng)發(fā)育特點(diǎn)及微進(jìn)化特征。
　　5、評價(jià)MLV

2、A在N.m暴發(fā)調(diào)查中的應(yīng)用，建立快速確定暴發(fā)相關(guān)菌株的方案。
　　研究方法：
　　1、菌株選擇。根據(jù)我國N.m數(shù)據(jù)庫中保存的菌株數(shù)量、三間分布及微生物學(xué)特征，通過定額抽樣、按比例分層抽樣及偶遇抽樣等方法選取菌株用于MLVA實(shí)驗(yàn)。
　　用于建立MLVA數(shù)據(jù)庫的菌株選擇時(shí)，根據(jù)課題設(shè)計(jì)，初步確定選擇200株N.m，采用按比例分層抽樣方法。
　　2、位點(diǎn)選擇。通過查閱文獻(xiàn)獲取用于N.m的VNTR位點(diǎn)，首先剔除報(bào)道中顯示

3、為如下結(jié)果的位點(diǎn):“多條帶”、“非所有菌株共有”、“多拷貝”、“單一條帶”及“側(cè)翼區(qū)現(xiàn)多態(tài)性”。將初步篩選后保留的位點(diǎn)用于我國N.m的MLVA預(yù)實(shí)驗(yàn)，分析PCR產(chǎn)物電泳條帶，按照“所有菌株中均可檢出”，且“多態(tài)性高”、“條帶單一”和“側(cè)翼區(qū)穩(wěn)定”等原則篩選合適的VNTR位點(diǎn)。
　　3、MLVA實(shí)驗(yàn)。提取菌株DNA，使用VNTR位點(diǎn)對應(yīng)的帶有熒光標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增;根據(jù)PCR產(chǎn)物確定STR內(nèi)標(biāo)，使用全自動(dòng)測序儀進(jìn)行STR檢測;

4、電泳圖譜即fsa文件經(jīng)GeneMapper軟件處理，生成PDF圖譜及Excel文件，獲得PCR產(chǎn)物片段大小;根據(jù)相應(yīng)位點(diǎn)重復(fù)序列及其側(cè)翼片段大小，計(jì)算樣本中該位點(diǎn)的重復(fù)數(shù)，將計(jì)算好的重復(fù)數(shù)以整數(shù)錄入MLVA數(shù)據(jù)庫。如果出現(xiàn)0.5個(gè)拷貝，則通過測序判定實(shí)際重復(fù)數(shù)，并在以后的試驗(yàn)中遵循此標(biāo)準(zhǔn)。
　　將每個(gè)菌株的對應(yīng)VNTR位點(diǎn)重復(fù)數(shù)提交到生物信息工具網(wǎng)站，計(jì)算各個(gè)VNTR位點(diǎn)在研究菌株中的改良Simpson差異性指數(shù)，對位點(diǎn)的分辨力進(jìn)

5、行評價(jià)，根據(jù)各個(gè)VNTR位點(diǎn)的分辨力設(shè)計(jì)不同的位點(diǎn)組合方案，將MLVA數(shù)據(jù)自Excel導(dǎo)入BioNumerics軟件，采用非加權(quán)組平均數(shù)法(UPGMA)進(jìn)行分析，獲取菌株的MLVA基因型及克隆群分布聚類圖。
　　4、MLST實(shí)驗(yàn)。通過MLST方法確定ST型及ST complex。采用N.m的7個(gè)管家基因進(jìn)行檢測，其結(jié)果經(jīng)測序后提交到MLST數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站，獲得各個(gè)基因?qū)?yīng)結(jié)果，再將7個(gè)基因?qū)?yīng)結(jié)果提交到數(shù)據(jù)庫中獲得相應(yīng)的ST型及ST

6、complex。將結(jié)果錄入我國N.m的MLST數(shù)據(jù)庫，并導(dǎo)入BioNumerics軟件，分析ST型分布特點(diǎn)。
　　5、根據(jù)分型數(shù)量，比較MLVA與MLST方法的分辨能力;根據(jù)聚類分析結(jié)果，判斷MLVA與MLST是否存在相似趨勢，分析我國NmC系統(tǒng)發(fā)育及微進(jìn)化特征。
　　研究結(jié)果：
　　1、自我國N.m細(xì)菌庫中篩選了52株細(xì)菌用于確定VNTR位點(diǎn)的MLVA預(yù)試驗(yàn)，這些菌株來自22個(gè)省的病人、密切接觸者及健康攜帶者。

7、>　　最終使用430株N.m建立MLVA數(shù)據(jù)庫，包括1977-1996年期間分離的16株A群和12株B群，以及2003-2014年間分離的含有8種血清群的402株N.m，其中含有山東省2010年流腦暴發(fā)調(diào)查時(shí)采集的49株細(xì)菌及2014年流腦暴發(fā)調(diào)查時(shí)采集的43株細(xì)菌。
　　2、共收集三篇文獻(xiàn)中報(bào)道的56個(gè)VNTR位點(diǎn)。經(jīng)過初篩，保留了19個(gè)不同的VNTR位點(diǎn)用于52株N.m的MLVA預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果有3個(gè)位點(diǎn)被剔除，其中2個(gè)位點(diǎn)在多個(gè)

8、菌株中未檢出，1個(gè)位點(diǎn)需要測序方能判斷PCR產(chǎn)物大小。最后保留16個(gè)VNTR位點(diǎn)用于我國N.m的MLVA研究。
　　3、使用上述16個(gè)VNTR位點(diǎn)對430株N.m進(jìn)行MLVA實(shí)驗(yàn)，共獲得6880個(gè)數(shù)據(jù)，將結(jié)果錄入Excel表格，初步建立了我國N.m的MLVA數(shù)據(jù)庫。同時(shí)對缺少ST型信息的122株N.m進(jìn)行MLST實(shí)驗(yàn)，增加了854個(gè)數(shù)據(jù)，完善了我國N.m的MLST數(shù)據(jù)庫。
　　4、對215株NmC的MLST和MLVA結(jié)果進(jìn)行

9、聚類分析，共分得29個(gè)ST型。而MLVA分型結(jié)果卻由于采用不同的VNTR位點(diǎn)而表現(xiàn)不完全一致。使用16個(gè)VNTR位點(diǎn)進(jìn)行分析時(shí)，215株NmC共分為201個(gè)MLVA型，182株ST-4821 complex NmC共分為176個(gè)MLVA型，118株ST-4821 NmC共分為112個(gè)MLVA型。其中6個(gè)VNTR位點(diǎn)的Nei's指數(shù)高于0.5，被稱作高變位點(diǎn)，其余10個(gè)VNTR位點(diǎn)被稱作穩(wěn)定位點(diǎn)。使用上述6個(gè)高變位點(diǎn)中的5個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行MLV

10、A的分型結(jié)果與使用16個(gè)位點(diǎn)的一致。采用10個(gè)穩(wěn)定位點(diǎn)進(jìn)行分析時(shí)，215株NmC分為55個(gè)MLVA基因型，182株ST-4821 complex NmC分為32個(gè)基因型，118株ST-4821 NmC共分為11個(gè)基因型。采用這10個(gè)穩(wěn)定位點(diǎn)進(jìn)行MLVA時(shí)，NmC系統(tǒng)發(fā)育特征與MLST結(jié)果存在相似趨勢。
　　5、使用5個(gè)穩(wěn)定位點(diǎn)建立的MLVA方案，對來自山東及安徽的兩起暴發(fā)調(diào)查中的56株N.m進(jìn)行分析，BioNumerics聚類分析

11、結(jié)果顯示，同一次流腦暴發(fā)中的暴發(fā)相關(guān)菌株聚成一簇，且與不相關(guān)菌株分開。同時(shí)，也有部分散發(fā)菌株也與暴發(fā)相關(guān)菌株聚成一簇。
　　研究結(jié)論：
　　1、N.m的MLVA方案應(yīng)結(jié)合菌株流行病學(xué)信息確定VNTR位點(diǎn)，不同國家分離的菌株使用的位點(diǎn)不盡相同。
　　2、MLVA方法適合我國N.m的基因多態(tài)性及系統(tǒng)發(fā)育特征分析，進(jìn)行MLVA實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要根據(jù)不同研究目的選擇合適的VNTR位點(diǎn)組合。研究菌株中VNTR位點(diǎn)多態(tài)性及菌株差異時(shí)，使

12、用5個(gè)高變位點(diǎn)組合的方案;研究菌株系統(tǒng)發(fā)育特點(diǎn)及菌株之間相似性時(shí)，使用10個(gè)穩(wěn)定位點(diǎn)組合的方案。
　　3、MLVA方法分辨能力強(qiáng)于MLST方法，可以采用5個(gè)高變位點(diǎn)分析我國NmC的基因多態(tài)性。本研究檢測的215株N.m，存在29個(gè)ST型和201個(gè)MLVA型。
　　4、MLST結(jié)果顯示，我國NmC存在多種克隆群，其中最主要的為ST-4821complex，該克隆群經(jīng)過近十年傳播，微進(jìn)化特征顯示細(xì)菌的VNTR位點(diǎn)存在基因多態(tài)性，

13、但MLST7個(gè)管家基因的聚類結(jié)果和MLVA中使用的10個(gè)穩(wěn)定VNTR位點(diǎn)的聚類結(jié)果，在這些菌株之間存在相似性。
　　5、采用5個(gè)穩(wěn)定VNTR位點(diǎn)組合進(jìn)行MLVA，可以用于ST-4821 NmC引起的同一次流腦暴發(fā)調(diào)查中，快速初篩暴發(fā)相關(guān)菌株。
　　創(chuàng)新和意義
　　1、建立了我國N.m的MLVA實(shí)驗(yàn)方法，初步建立了MLVA數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫中菌株覆蓋年代、地區(qū)及人群廣泛，包含了1977-2014年間23個(gè)年份、來自我國27個(gè)

14、省的病人、密切接觸者和健康人群的N.m;菌株類別詳盡，包括8個(gè)血清群、111個(gè)ST型和114個(gè)PFGE型。
　　流學(xué)病學(xué)調(diào)查中，如果分離到了N.m或是僅僅采集到患者的咽拭子等標(biāo)本時(shí)，可以提取DNA進(jìn)行MLVA實(shí)驗(yàn)，不會因?yàn)闆]有獲得菌株而缺少病原學(xué)信息。將新獲得標(biāo)本的MLVA結(jié)果提交到數(shù)據(jù)庫中比對，判斷其是否為新出現(xiàn)的類型。如果為數(shù)據(jù)庫已有的MLVA型，可以比較新分離菌株與數(shù)據(jù)庫中菌株的流行病學(xué)背景信息，進(jìn)一步分析其可能的傳播途徑;

15、如果為新的MLVA型，可以完善數(shù)據(jù)庫，同時(shí)根據(jù)菌株各個(gè)VNTR位點(diǎn)的重復(fù)數(shù)，觀察相同血清群或克隆群菌株之間的相同位點(diǎn)及差異位點(diǎn)，分析特定血清群或克隆群菌株VNTR位點(diǎn)多態(tài)性，尋找其微進(jìn)化規(guī)律。
　　2、首次使用MLVA方法分析我國流NmC微進(jìn)化特征，證明了我國特有的ST-4821 NmC并非同一克隆，菌株之間VNTR位點(diǎn)多態(tài)性明顯。提出可根據(jù)研究目的，選擇不同VNTR位點(diǎn)組合方案用于N.m的MLVA研究。
　　ST-4821

16、 NmC自出現(xiàn)之日起，幾乎每年都從病人或健康攜帶者體內(nèi)分離到該菌，雖然血清群、ST型等實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，但是這些菌株的VNTR位點(diǎn)重復(fù)數(shù)并不是完全一致，對這些菌株的微進(jìn)化特征進(jìn)行研究，能夠發(fā)現(xiàn)與表型相關(guān)的關(guān)鍵遺傳改變，為尋找N.m在致病能力、耐藥性等方面的變異源頭以及其適應(yīng)環(huán)境的基礎(chǔ)提供依據(jù)。本研究中采用16個(gè)VNTR位點(diǎn)進(jìn)行MLVA實(shí)驗(yàn)，基于不同研究目的選擇不同位點(diǎn)組合進(jìn)行分析，既能夠了解ST-4821 NmC之間的共性，又能夠發(fā)現(xiàn)它們之

17、間存在的差異，尤其適合為了解決不同問題而進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查研究，可以同時(shí)分析這類菌株在傳播、流行及致病過程中發(fā)生的有利遺傳和不利變異。
　　3、首次將MLVA方法用于我國流腦暴發(fā)中暴發(fā)相關(guān)菌株的快速初篩，并分析了使用5個(gè)穩(wěn)定VNTR位點(diǎn)進(jìn)行MLVA實(shí)驗(yàn)在判斷暴發(fā)相關(guān)菌株中應(yīng)用的可行性及局限性。
　　當(dāng)暴發(fā)流腦疫情時(shí)，臨床醫(yī)生及流行病學(xué)工作者會第一時(shí)間采集病人及其密切接觸者的標(biāo)本，但樣本的分離培養(yǎng)成功率并不高。因此，可以在細(xì)菌