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文檔簡介
1、[背景與目的]
肺癌,作為我國乃至世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一,近年來仍有逐漸增高的發(fā)病趨勢。非小細(xì)胞肺癌約占全部肺癌的80%,早期診斷困難是其一個重要的特點,約七成的患者確診時已失去了手術(shù)機會,肺癌的早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是一個重要因素。Syk(the Spleen tyrosine kinase,Syk)是一種非受體酪氨酸激酶,長期大量的研究表明其不僅在所有造血細(xì)胞中表達(dá),而且在諸如血管內(nèi)皮細(xì)胞、鼻成纖維細(xì)胞、乳
2、腺上皮細(xì)胞及胰腺上皮細(xì)胞等非造血細(xì)胞中也有廣泛的表達(dá)。同時,在乳腺癌、胃癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤的研究中,也發(fā)現(xiàn)了Syk的潛在抑制效應(yīng)。還有進(jìn)一步的研究證實:Syk在正常的乳腺組織、乳腺癌旁組織以及侵襲性乳腺癌組織中的表達(dá)程度逐漸降低,在高度侵襲性乳腺腫瘤中常檢測不到其表達(dá);在胃癌組織中運用RT-PCR法未檢測到syk基因的表達(dá);陳明霞等人運用類似的方法研究了胰腺癌組織,同時也得出了相似的結(jié)論。近年來實驗證實血管內(nèi)皮生長因子-C(vas
3、cular endothelial growth factor-C,VEGF-C)也具有促進(jìn)淋巴管生成作用,因此又稱為淋巴管生成因子,VEGFR-3是其特異性受體,它們可促進(jìn)早期淋巴管生成和腫瘤淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移?,F(xiàn)有學(xué)者推測,Syk相關(guān)信號通路可能通過影響淋巴管生成因子VEGF-C/VEGFR-3通路起作用,再從而抑制腫瘤淋巴管的生成。盡管肺癌甲基化方面的研究已經(jīng)很多,但無論在Syk基因表達(dá)還是甲基化對其表達(dá)調(diào)控方面報道均較少,我們希望通過
4、RT-PCR的方法檢測Syk、VEGF-C在非小細(xì)胞肺癌組織、癌旁組織及正常肺組織的表達(dá)。通過本實驗,我們擬探討脾酪氨酸激酶(Syk)和血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)對非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響以及二者之間的潛在聯(lián)系,達(dá)到對Syk與非小細(xì)胞肺癌關(guān)系初步研究的目的。
[材料與方法]
1.選取山東大學(xué)第二醫(yī)院自2009年1月到2011年12月期間手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本81例,標(biāo)本包括非小細(xì)胞肺癌肺癌組
5、織、癌旁組織和正常肺組織,常規(guī)石蠟包埋、切片,應(yīng)用RT-PCR的方法,研究Syk、VEGF-C在非小細(xì)胞肺癌組織、癌旁組織和正常肺組織中的表達(dá),并運用統(tǒng)計學(xué)分析,初步明確肺組織從正常到癌旁組織、肺癌組織的癌變過程中Syk與VEGF-C表達(dá)的相關(guān)性,并探討不同年齡、性別、組織類型、分化程度及分期的非小細(xì)胞肺癌組織中Syk的表達(dá)是否有顯著性差異。
2.細(xì)胞侵襲實驗檢測Syk、VEGF-C在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá),并研究其潛在
6、聯(lián)系。
(1).構(gòu)建攜帶人VEGF-C基因片段的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-VEGF-C及含有Syk基因片段的真核表達(dá)載體pLNCXSyk;
(2).經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549;
(3).篩選出穩(wěn)定生長的細(xì)胞后,采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的方法分別檢測 VEGF-CmR
7、NA和Syk mRNA的表達(dá);
(4).采用transwell小室法構(gòu)建體外侵襲模型進(jìn)行檢測。
構(gòu)建含人VEGF-C基因的真核表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)染至人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549中,并設(shè)置空載組進(jìn)行對照,用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法檢測兩組中VEGF-C的表達(dá),取對數(shù)生長期各組細(xì)胞構(gòu)建體外侵襲模型,計算侵襲細(xì)胞數(shù)目;同樣方法處理Syk組。分析VEGF-C和Syk的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性
8、及二者之間的相互作用。
[實驗結(jié)果]
1.非小細(xì)胞肺癌組織、癌旁組織及正常肺組織中Syk表達(dá)陽性率分別為4.9%,92.6%,100%,肺癌組織中Syk表達(dá)與正常肺組織中及癌旁組織Syk表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),癌組織中的表達(dá)低于正常組織中及癌旁組織;非小細(xì)胞肺癌組織、癌旁組織及正常肺組織中VEGF-C的表達(dá)陽性率分別為88.9%,12.3%,2.5%,肺癌組織中VEGF-C表達(dá)與正常肺組織及癌旁
9、組織中VEGF-C表達(dá)有顯著性差異(P<0.05),其表達(dá)高于正常肺組織及癌旁組織;正常肺組織及癌旁組織中VEGF-C的表達(dá)無顯著性差異(p>0.05); Syk與VEGF-C的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(r=-1.000,P=0.000);不同性別、年齡的患者,不同組織類型、分化程度及分期的患者其Syk表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。
2.RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳證實,VEGF-C在轉(zhuǎn)染組及空載組均有表達(dá),細(xì)胞侵襲試驗示轉(zhuǎn)染組
10、侵襲細(xì)胞數(shù)為50.29±7.56、空載組為20.143±1.51,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳表明Syk基因在轉(zhuǎn)染組有表達(dá),而空載組則沒有表達(dá),細(xì)胞侵襲試驗示轉(zhuǎn)染組侵襲細(xì)胞數(shù)為12.29±2.75、空載組為5±1.73,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
[實驗結(jié)論]
1.非小細(xì)胞肺癌組織中Syk的表達(dá)顯著降低,而VEGF-C的表達(dá)顯著增高,兩者表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。Syk的表達(dá)在非小
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