輔助生殖技術(shù)妊娠安全性臨床分析及胎盤蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、輔助生殖技術(shù)應(yīng)用于臨床30余年，在對(duì)各種不育癥治療作出巨大貢獻(xiàn)的同時(shí)，也促使了人們對(duì)其操作安全性和子代健康的關(guān)注。近年來(lái)，有研究不斷指出，ART可能會(huì)增加子代不良健康風(fēng)險(xiǎn)，包括出生缺陷、出生體重低下、染色體異常、腫瘤及由基因表觀遺傳修飾異常導(dǎo)致的罕見(jiàn)遺傳病發(fā)病等。由于ART各項(xiàng)技術(shù)的直接臨床應(yīng)用均無(wú)實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)研究背景，所以，ART增加子代不良健康風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生機(jī)制并不清楚。ART所涉及的各個(gè)環(huán)節(jié)，包括父母的不孕背景和大量非生理性干預(yù)，如超

2、促排卵、配子和胚胎體外培養(yǎng)、胚胎移植、胚胎顯微操作等步驟均有可能改變生命早期的發(fā)育，從而影響子代甚至再下一代的健康。面對(duì)目前人們對(duì)ART子代健康的擔(dān)憂以及未來(lái)可能潛藏的更多危險(xiǎn)，對(duì)ART的出生缺陷機(jī)制進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)估已經(jīng)刻不容緩。
　　 目前，多個(gè)國(guó)家的生殖協(xié)會(huì)或ART中心都開(kāi)始對(duì)ART子代進(jìn)行大型的流行病學(xué)調(diào)查。但是，大量關(guān)于ART安全性的評(píng)估，多集中于對(duì)新生兒結(jié)局的描述，而對(duì)妊娠并發(fā)癥的描述較少，且結(jié)果不確定。關(guān)于ART新生兒

3、不良結(jié)局發(fā)生的原因分析更少。相關(guān)國(guó)內(nèi)資料尤其缺乏。妊娠并發(fā)癥是妊娠期或分娩過(guò)程中出現(xiàn)的病理情況，一方面是異常妊娠過(guò)程的臨床表現(xiàn)，另一方面，也是影響母兒健康的關(guān)鍵因素。因此，進(jìn)一步對(duì)ART妊娠相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生情況和妊娠結(jié)局的關(guān)系進(jìn)行分析，有助于ART子代的全面安全性評(píng)估，從而更好的分析ART子代不良健康風(fēng)險(xiǎn)增加的可能原因和機(jī)制。
　　 胎盤是孕期連接胎兒和母體的重要器官，在妊娠過(guò)程中起物質(zhì)交換和內(nèi)分泌作用維持胎兒生長(zhǎng)并保護(hù)胎兒免受

4、外界損傷。胎盤微血管的生成及其網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建是母兒物質(zhì)交換的保證，對(duì)于正常妊娠的維持有著十分重要的意義。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)胚胎經(jīng)體外培養(yǎng)后常伴有妊娠過(guò)程中的胎盤發(fā)育異常，人類ART子代也伴隨胎盤發(fā)育異常幾率增加，但發(fā)生機(jī)制不清。因此，對(duì)ART子代胎盤功能進(jìn)行全面的檢測(cè)，并對(duì)相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行研究，有助于進(jìn)一步評(píng)價(jià)ART操作對(duì)于胎盤發(fā)育和胎兒發(fā)育的影響，并探討其因果關(guān)系。
　　 本研究以輔助生殖技術(shù)子代為研究對(duì)象，首先對(duì)ART妊娠并發(fā)癥和妊娠結(jié)

5、局進(jìn)行臨床分析；以臨床發(fā)現(xiàn)ART妊娠和分娩并發(fā)癥及新生兒不良結(jié)局發(fā)生率較自然妊娠顯著增加為基礎(chǔ)，應(yīng)用高通量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，對(duì)ART子代胎盤差異蛋白表達(dá)譜進(jìn)行全面檢測(cè)和分析；以實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ART胎盤存在差異表達(dá)蛋白為基礎(chǔ)，選取重點(diǎn)差異蛋白，分析目的蛋白在ART出生體重低下子代胎盤中的表達(dá)及相關(guān)病理機(jī)制，探討ART胎盤發(fā)育與子代低出生體重發(fā)生的關(guān)系；總體評(píng)價(jià)ART技術(shù)安全性，分析ART不良妊娠結(jié)局發(fā)生的胎盤分子機(jī)制，并為臨床改進(jìn)ART操作、

6、改善ART結(jié)局提供理論依據(jù)。
　　 第一部分：輔助生殖技術(shù)晚期妊娠并發(fā)癥和妊娠結(jié)局臨床分析
　　 目的：評(píng)價(jià)ART獲得妊娠與自然獲得妊娠相比，是否存在妊娠晚期并發(fā)癥和分娩并發(fā)癥發(fā)生率及新生兒結(jié)局的差異；分析新生兒不良結(jié)局和ART妊娠并發(fā)癥發(fā)生的關(guān)系。
　　 材料與方法：回顧性分析2003-2009年在我院分娩的ART妊娠(包括常規(guī)IVF和ICSI)1013例，以1:3配對(duì)、年齡匹配方式隨機(jī)抽取同期在我院分娩的自然

7、妊娠3069例作為對(duì)照組，比較兩組之間多胎發(fā)生率、妊娠和分娩并發(fā)癥發(fā)生率及新生兒結(jié)局是否存在差異。再將兩組分為單胎妊娠和多胎妊娠后，分別統(tǒng)計(jì)以上指標(biāo)是否存在差異。并進(jìn)一步分析ART新生兒低出生體重和早產(chǎn)與妊娠并發(fā)癥發(fā)生的關(guān)系。
　　 結(jié)果：ART組多胎發(fā)生率為37.8％，為自然妊娠組的20.9倍。ART組妊娠并發(fā)癥及分娩并發(fā)癥[包括妊娠期高血壓、子癇前期、妊娠期糖尿病( GDM)、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥等( ICP)、前置胎盤、胎

8、盤早剝、足月前胎膜早破(PPROM)、胎盤粘連、產(chǎn)后出血等]和新生兒早產(chǎn)、低出生體重、足月小樣兒、新生兒窒息等發(fā)生率均顯著高于自然妊娠組；相反，巨大兒發(fā)生率顯著低于自然妊娠組。ART單胎妊娠和自然單胎妊娠相比，子癇前期、GDM、前置胎盤、PPROM、臍帶附著異常、胎盤粘連、產(chǎn)后出血及新生兒早產(chǎn)、低出生體重、新生兒窒息等發(fā)生率仍顯著增加。ART多胎妊娠和自然多胎妊娠相比，各妊娠并發(fā)癥和分娩并發(fā)癥發(fā)生率無(wú)明顯差異，新生兒足月小樣兒和雙胎發(fā)育

9、不均衡發(fā)生率顯著低于對(duì)照組。ART新生兒低出生體重主要由早產(chǎn)引起，而在ART早產(chǎn)友生原因中，合并妊娠并發(fā)癥者占73.2％，其中合并PPROM、ICP、妊娠期高血壓疾病和前置胎盤的比率最高。
　　 結(jié)論：ART與妊娠并發(fā)癥、分娩并發(fā)癥發(fā)生率升高和新生兒不良結(jié)局相關(guān)，其原因與醫(yī)源性的多胎妊娠密切相關(guān)。排除多胎因素后，ART單胎妊娠仍存在子癇前期、GDM等并發(fā)癥發(fā)生率增高和新生兒結(jié)局不良，提示ART本身也與病理妊娠相關(guān)。ART新生兒低

10、出生體重的發(fā)生主要由早產(chǎn)引起，并和妊娠并發(fā)癥，特別是胎盤發(fā)育異常疾病的發(fā)生密切相關(guān)。因此，提倡單胚胎移植，嚴(yán)格控制ART適應(yīng)癥，改進(jìn)臨床ART操作，盡量減少非生理性干預(yù)，積極預(yù)防和治療妊娠并發(fā)癥有助于改善臨床ART安全性。
　　 第二部分：輔助生殖技術(shù)子代胎盤比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 目的：研究ART子代胎盤與自然妊娠子代胎盤相比總蛋白表達(dá)譜的改變，探討ART增加子代不良健康風(fēng)險(xiǎn)的胎盤分子機(jī)制。
　　 材料與方法

11、：6例常規(guī)IVF-ET妊娠，6例ICSI妊娠和6例同期自然妊娠胎盤提取細(xì)胞總蛋白，二維凝膠電泳分離蛋白組成分，銀染染色后應(yīng)用PDQuest軟件分析數(shù)字化的凝膠圖像，找出ART胎盤組織表達(dá)有差異的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)；采用膠內(nèi)酶解消化方式得到差異蛋白斑點(diǎn)多肽混合物，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定；所有差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)檢索、歸類和功能分析；選取獲得成功鑒定的代表性差異蛋白進(jìn)行Western blotting驗(yàn)證。
　　

12、 結(jié)果：1、通過(guò)分析二維電泳凝膠圖譜，各胎盤組織檢測(cè)到約1200個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。常規(guī)IVF組和對(duì)照組比較，12個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)具有顯著差異，其中7個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，5個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。ICSI組和對(duì)照組比較，18個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)具有明顯差異，其中10個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，8個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。其中6個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在常規(guī)IVF組和ICSI組中均具有表達(dá)改變，且變化趨勢(shì)一致。2、通過(guò)膠內(nèi)酶解消化、MALDI TOF-TOF分析得到差異表達(dá)蛋白斑點(diǎn)

13、的肽質(zhì)指紋圖譜，通過(guò)MASCOT搜索引擎在NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，其中20個(gè)蛋白斑點(diǎn)成功獲得鑒定，其中5個(gè)蛋白Annexin A3，α-SNAP，hnRNPCl/C2，F(xiàn)TL和ATP5A在常規(guī)IVF組和ICSI組中均有表達(dá)差異。3、應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)蛋白進(jìn)行歸類和功能分析，差異表達(dá)蛋白功能涉及胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞骨架和核酸代謝等多個(gè)方面。4、應(yīng)用Western blotting方法對(duì)代表性蛋白AnnexinA3，α-SN

14、AP，hnRNP Cl/C2和FTL進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與二維電泳一致。
　　 結(jié)論：ART妊娠子代胎盤組織中存在與胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞骨架和核酸代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)變化，提示ART操作可能導(dǎo)致胎盤發(fā)育的異常，而機(jī)體也存在相應(yīng)的保護(hù)性措施和代償機(jī)制進(jìn)行糾正。該結(jié)果初步篩選了ART相關(guān)胎盤差異表達(dá)蛋白，為深入探討ART妊娠過(guò)程中的胎盤異常發(fā)育機(jī)制，進(jìn)一步明確ART與不良妊娠結(jié)局和子代健康之間的關(guān)系提供了可靠的資料。
　　

15、 第三部分：Annexin A3和α-SNAP在ART低出生體重子代胎盤中的表達(dá)及意義
　　 目的：檢測(cè)ART低出生體重子代胎盤中annexin A3和α-SNAP的表達(dá)水平，分析其與胎盤微血管生成的關(guān)系，并探討annexin A3和α-SNAP表達(dá)在ART子代低出生體重發(fā)生中的胎盤分子病理機(jī)制。
　　 材料和方法：以12例ART妊娠合并低出生體重(LBW)，12例ART妊娠正常出生體重( NBW)和12例同期自然妊娠

16、子代胎盤為研究對(duì)象，采用Westernblotting方法檢測(cè)ART/LBW組、ART/NBW組和對(duì)照組中annexin A3和α-SNAP表達(dá)量的差異。采用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)一步檢測(cè)annexin A3和α-SNAP在ART/LBW組、ART/NBW組和對(duì)照組胎盤組織中的定位和表達(dá)差異，用CD34標(biāo)記代表微血管密度( MVD)方法比較三組間胎盤絨毛微血管分布及密度，并分析胎盤annexin A3和α-SNAP表達(dá)與MVD的相關(guān)性。

17、r>　　 結(jié)果：Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ART/LBW組胎盤中annexinA3和α-SNAP的表達(dá)顯著下降，ART/NBW組annexin A3和α-SNAP的表達(dá)顯著上調(diào)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示annexin A3和α-SNAP在胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞及絨毛間質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)，表達(dá)水平與western blotting結(jié)果一致。ART/LBW組胎盤組織中MVD較對(duì)照組顯著下降，ART/NBW組M