CUL5 E3ligase體外泛素化系統(tǒng)的建立.pdf

1、人體細(xì)胞存在多種蛋白降解途徑，通過26S蛋白將被泛素標(biāo)記的蛋白質(zhì)底物降解這種細(xì)胞的自我調(diào)節(jié)方式，與許多如病毒感染、腫瘤、癌癥等疾病的發(fā)生有著重要聯(lián)系。其中HIV-1病毒的感染更是多年來的研究熱點(diǎn)，然而現(xiàn)今使用的治療手段仍存在各種各樣的缺陷。Vif作為HIV重要的輔助因子，能夠?qū)POBEC3G募集到CUL5 E3 ligase復(fù)合體上，使A3G被泛素化，并通過泛素—蛋白酶體途徑將其降解。目前針對泛素蛋白酶體系統(tǒng)的治療疾病的新方法迅速成為

2、了研究熱點(diǎn)。因此本研究目的為設(shè)計(jì)建立CUL5 E3 ligase體外泛素化系統(tǒng)，為研究該泛素化系統(tǒng)功能以及各組分間的相互作用，進(jìn)一步探索治療艾滋病的作用機(jī)制，有較大的現(xiàn)實(shí)意義。更重要的是，成功的建立起的CUL5 E3 ligase體外泛素化系統(tǒng)課作為一種工具，可通過更換底物蛋白或有相互作用的蛋白組分，研究其他蛋白之間的泛素化作用機(jī)理。因此本體系的建立也可能為多種目前沒有相對有效治療方法的疾病涉及蛋白的相互作用機(jī)制，提供一個有效的研究途徑

3、。
　　本文主要進(jìn)行兩方面研究:(1)表達(dá)純化CUL5 E3 ligase體外泛素化系統(tǒng)內(nèi)所有相關(guān)蛋白。首先將該系統(tǒng)內(nèi)蛋白的基因進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化得到陽性單克隆后，進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)，并通過相應(yīng)的親和層析進(jìn)行純化。進(jìn)一步通過FPLC分離提取高純度蛋白。實(shí)驗(yàn)同時(shí)優(yōu)化了系統(tǒng)內(nèi)各蛋白純化的方法，讓原難以表達(dá)的蛋白，通過共表達(dá)被順利純化。(2)檢測CUL5 E3 ligase體外泛素化系統(tǒng)活性。通過Western blotting對