喹賽多對雞沙門氏菌的PK-PD同步模型研究.pdf

1、雞沙門氏菌病是由沙門氏菌屬的致病性沙門氏菌引起的細(xì)菌性傳染病，具有垂直傳播、雛雞死亡率高等特點，給禽類養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。喹賽多是具有防治動物疾病并且能夠改善生產(chǎn)性能的喹噁啉類新品種藥物，對畜禽及魚類均具有廣譜抗菌和提高飼料利用率的作用。喹賽多對雞沙門氏菌具有優(yōu)良的抗菌活性，提示其具有應(yīng)用于防治雞沙門氏菌感染的應(yīng)用前景。然而，科學(xué)的合理給藥方案尚待建立。PK-PD模型可以綜合反映宿主、藥物和病原菌三者之間的關(guān)系，能夠指導(dǎo)臨床用藥在

2、達到最佳療效的同時降低耐藥菌的產(chǎn)生。本研究通過開展喹賽多對雞沙門氏菌體外和半體內(nèi)藥效研究以及喹賽多在雞回腸內(nèi)的代謝動力學(xué)研究，采用WinNonlin軟件擬合喹賽多對雞沙門氏菌的PK-PD模型，制定喹賽多治療雞沙門氏菌性腹瀉的合理給藥方案，為喹賽多在臨床上的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。本研究主要內(nèi)容包括：
　　 ⑴喹賽多對沙門氏菌cvcc528的抗菌活性研究。采用CLSI相關(guān)文件推薦肉湯稀釋法測定喹賽多及其主要代謝物(Cy1、Cy2、C

3、y4、Cy6、Cy9、Cy12)分別在MH肉湯和雞回腸內(nèi)容物中對沙門氏菌cvcc528的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。結(jié)果表明，喹賽多在厭氧條件下具有較好的殺菌作用，在MH肉湯中其MIC和MBC分別為2μ, g/mL和4μg/mL;在回腸內(nèi)容物中喹賽多的MIC也為2μ, g/mL。其主要代謝物中只有Cy9(2-甲酰甲酰腙-喹噁啉-N1，N4-二氧化物)具有抗菌活性，在MH肉湯中Cy9的MIC也是2μg/mL。根據(jù)喹賽多

4、對cvcc528的最低抑菌濃度(MIC)結(jié)果，配制1/2×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC、32×MIC的系列喹賽多濃度肉湯進行殺菌實驗，接種細(xì)菌后各組的細(xì)菌濃度均為106CFU/mL，厭氧條件下培養(yǎng)1、2、4、6、8、12、24h后分別取出100μL，梯度稀釋后用傾倒法計數(shù)，繪制抑菌曲線。結(jié)果表明，喹賽多抑菌曲線與已知為濃度依賴型的氟喹諾酮類抗生素類似均隨藥物濃度的增加，殺菌活性增大，殺菌時間變短。

5、這表明喹賽多對沙門氏菌的殺菌類型為濃度依賴型。采用藥物和細(xì)胞共同孵育的方法測定喹賽多對細(xì)胞內(nèi)沙門氏菌的藥效:采用的細(xì)胞為對沙門氏菌易感的RAW264.7，用沙門氏菌進行感染，加入慶大霉素以殺滅胞外菌，更換細(xì)胞培養(yǎng)液后構(gòu)建感染細(xì)胞體系。將其與2、8、20μg/mL的喹賽多共同孵育。在4h、8h、24h后吸出培養(yǎng)液，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞以釋放出胞內(nèi)菌，梯度稀釋后進行活菌計數(shù)，繪出抑菌曲線。實驗結(jié)果顯示，與空白對照組比較，喹賽多組能明顯抑制細(xì)

6、胞內(nèi)沙門氏菌的生長，并且隨著藥物濃度的增加抑制作用增強，當(dāng)添加藥物濃度達到20μg/mL時細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌不再增殖。采用藥物去除的方法測定喹賽多對cvcc528的抗生素后效應(yīng)(PAE):將沙門氏菌與濃度為1×MIC、2×MIC、4×MIC喹賽多接觸一定時間后，采用高度稀釋的方法去除藥物，取除藥后的菌液加入肉湯培養(yǎng)基，然后于不同時間點取培養(yǎng)液進行細(xì)菌計數(shù)。建立不同濃度處理后沙門氏菌恢復(fù)生長的動力學(xué)曲線。按照公式PAE=T-C計算抗菌藥后效應(yīng)的長

7、短。結(jié)果表明，喹賽多不具有抗生素后效應(yīng)，當(dāng)喹賽多藥物濃度達到4MIC與沙門氏菌接觸2小時后細(xì)菌已被完全殺滅，重建后沒有檢測到細(xì)菌。采用瓊脂平板法測定喹賽多對cvcc528的最小防突變濃度(MPC):配制含喹賽多系列濃度的瓊脂平板，濃縮雞白痢沙門氏菌至1010CFU/mL，接種1010CFU細(xì)菌于配制好的瓊脂平版上，連續(xù)培養(yǎng)72h。結(jié)果表明，瓊脂平板上沒有細(xì)菌生長的最低藥物濃度即厭氧條件下喹賽多對cvcc528的最小防突變濃度(MPC)為

8、40μg/mL。喹賽多對回腸內(nèi)容物中沙門氏菌的殺菌曲線繪制:灌胃給藥后不同時間點采集的回腸內(nèi)容物樣品經(jīng)過濾除菌后，接種等量沙門氏菌cvcc528，置于厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在0、1、2、4、8、12、24h，采用傾倒法進行菌落計數(shù)，得到各個時間點活菌數(shù)后繪制殺菌曲線。結(jié)果表明，高濃度組(＞10μg/mL)在體外培養(yǎng)4h后細(xì)菌數(shù)目變化最為明顯，已經(jīng)檢測不到細(xì)菌;低濃度組(2～10μp/mL)體外培養(yǎng)12h后出現(xiàn)細(xì)菌數(shù)目緩慢下降的現(xiàn)象;當(dāng)藥物濃度

9、低于最低抑菌濃度(2μg/mL)時，部分細(xì)菌受到抑制，細(xì)菌的增長幅度略低于空白對照組，表明這些組藥物濃度不能抑制細(xì)菌生長;試驗中沒有檢測到細(xì)菌出現(xiàn)反彈生長的現(xiàn)象。
　　 ⑵喹賽多在雞腸道和血漿中的藥代動力學(xué)研究。實驗選用100只30日齡三黃肉雞，按體重隨機分為二組，每組50只。選擇一組攻毒沙門氏菌cvcc528，構(gòu)建沙門氏菌腹瀉模型。兩組實驗動物均按照30mg/kg體重灌胃給藥。所有雞灌胃給藥結(jié)束后，在0.5h、1h、2h、3h

10、、4h、6h、8h、12h、24h、48h分別取5只雞進行定點宰殺，取其血液和回腸內(nèi)容物。采用高效液相色譜法檢測各時間點血漿和回腸內(nèi)容物中的喹賽多濃度。結(jié)果表明:喹賽多在血漿中最高濃度為0.016μg/mL，尚未達到喹賽多的最低抑菌濃度(MIC=2μg/mL)，所以不滿足模型的要求。健康雞各時間點回腸內(nèi)容物中喹賽多濃度分別為:205.87、234.26、293.81、49.4、13、2.15、0.59、0.42、0.36μg/mL，患病

11、雞各時間點回腸內(nèi)容物中喹賽多濃度分別為:57.02、110.58、157.52、53.54、17.31、3.71、2.37、0.74、0.4μg/mL。經(jīng)過Winnonlin軟件模擬得到喹賽多在雞回腸內(nèi)的代謝參數(shù)，經(jīng)單次口服灌胃后喹賽多在腸內(nèi)代謝過程均符合有吸收一室模型。喹賽多在雞的腸道內(nèi)代謝較快，最高藥物濃度Cmax為143.28～283.34μg/mL;達到最高濃度時間Tmax為1.08～1.32h; T1/2為0.62～0.67h

12、;有效持續(xù)時間T＞MIC為5.23～6.36h;曲線下面積AUC為379.22～691.84h·μg/mL。由健康模型和疾病模型的代謝參數(shù)可看出，喹賽多在健康雞體內(nèi)的Cmax值和AUC值與在疾病模型中的相應(yīng)值存在顯著差異，分析其原因可能是由于健康雞在感染沙門氏菌后腸道菌群對喹賽多的代謝以及相關(guān)的藥物代謝酶活性發(fā)生變化而導(dǎo)致。
　　 ⑶喹賽多對雞沙門氏菌cvcc528耐藥風(fēng)險評估。向含有1、2、4、8、16、32、64μg/mL喹

13、賽多的MH肉湯中接種等量的細(xì)菌，各瓶中細(xì)菌的濃度為109CFU/mL，厭氧培養(yǎng)適當(dāng)時間后取100μL在含8μg/mL(4×MIC)的喹賽多瓊脂平板上厭氧培養(yǎng)相應(yīng)時間后進行活菌落計數(shù)，當(dāng)菌落數(shù)在100CFU內(nèi)為自然條件下產(chǎn)生的耐藥突變菌，菌落數(shù)大于100CFU時為實驗條件下產(chǎn)生的突變耐藥菌。實驗結(jié)果表明，空白組及藥物濃度低于MIC(2μg/mL)組，除少部分沒有產(chǎn)生耐藥外，大部分會都出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。產(chǎn)生耐藥性比較密集的是在MIC(2μg/m

14、L)至MPC(40μg/mL)范圍內(nèi)。但是當(dāng)藥物濃度接近MPC增大到32μg/mL時，接觸24小時后不再有耐藥菌產(chǎn)生。當(dāng)藥物濃度大于MPC(40μg/mL)時，細(xì)菌不再產(chǎn)生耐藥性。結(jié)合MSW理論，藥物濃度低于MIC時大部分沙門氏菌還是產(chǎn)生了耐藥性，實驗結(jié)果與MSW理論不太相符。說明給藥劑量必須使患病部位藥物濃度達到MPC才能抑制細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。綜上所述，根據(jù)實驗測得的給雞灌胃30mg/kg體重后回腸內(nèi)容物中的藥物濃度，如果采用每天給藥2

15、～3次，24小時內(nèi)喹賽多藥物濃度高于MPC的時間占到了40％左右，能夠迅速殺滅耐藥菌;理論不會產(chǎn)生耐藥菌。每天給藥一次則達到MPC值的時間較短，低濃度喹賽多與沙門氏菌接觸時間較長，存在耐藥菌富集的風(fēng)險。4 PK-PD模型的擬合與給藥方案的制定喹賽多對沙門氏菌的體外抑菌實驗確定了喹賽多的抗菌類型為濃度依賴型，因此，擬合模型時我們參考的PK-PD參數(shù)為半體內(nèi)的AUC/MIC和Cmax/MIC。
　　 ⑷通過Sigmoid Emax模

16、型分別擬合Cmax/MIC及AUC/MIC與抗菌療效之間的關(guān)系。通過得到方程發(fā)現(xiàn)Cmax/MIC和AUC/MIC兩個參數(shù)最終所得的結(jié)果相當(dāng)。最終選定的PK-PD擬合方程為E=2.72-7.3*C1.63/335.93163+ C1.63，反映的是半體內(nèi)AUC/MIC值與抗菌療效之間的相互關(guān)系，當(dāng)E=0、-3、-4(抑菌、殺菌、根除)時，對應(yīng)的C值，即半體內(nèi)AUC/MIC值分別為244.02、739.66、1509.99。結(jié)合給藥方程X=

17、d×AUCex vivo/ MICtested/A UCin vivo/ MICtarget，可計算得出最佳給藥劑量X(mg/kg/d)。當(dāng)臨床分離菌MIC=2μg/mL，E=0、-3、-4(抑菌、殺菌、根除)時，對應(yīng)的X值，即給藥劑量為21.16、64.14、130.95mg/kg/d。對于不同情況，我們可以制定不同的給藥方案:對于沙門氏菌病的預(yù)防用藥，可按20mg/kg體重給藥;治療用藥，可按65mg/kg體重給藥;按130mg/k

18、g體重給藥時理論上可根除細(xì)菌，避免耐藥菌的產(chǎn)生?？紤]到農(nóng)戶大都采用雞場規(guī)?；B(yǎng)殖，口服給藥比較繁瑣，因此將給藥方式轉(zhuǎn)換為混飼。群體給藥公式為D=d×n/W，d為按體重給藥量;n為每天給藥次數(shù);W為不同年齡段雞的體重和采食量的轉(zhuǎn)換比，21日齡的小雞的W值約為120g/kg/d;D為群體混飼給藥量。如果臨床分離菌MIC值為2μg/mL，作為臨床治療用藥，由此得到最佳群體混飼給藥量為1.08g/kg飼料給藥，每天飼喂兩次。綜上所述，本課題闡明