FOXA1基因變異和調(diào)控異常促進肝癌發(fā)生與轉(zhuǎn)移的機制研究.pdf

1、肝細胞癌是常見的高度惡性腫瘤，其病程短、發(fā)展快、死亡率高，嚴重威脅著人類的健康。由于肝癌發(fā)病機制十分復(fù)雜，科學(xué)界對其發(fā)病原因尚無定論，已知的誘因包括病毒感染、黃曲霉毒素攝入、肝臟長期慢性炎癥、肝硬化等，而性別差異是HCC發(fā)生發(fā)展的一個非常重要的特征。人群流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn):男性HCC平均發(fā)病率是女性的3-5倍，而對于年齡在50歲以下的男性，HCC發(fā)病率則達到女性的7-10倍。在預(yù)后方面，男性患者生存率低、生存期短，而女性治療后具有相對較高

2、的生存率和較低的復(fù)發(fā)率。目前普遍認為:這種性別差異主要是由男女體內(nèi)性激素水平及相應(yīng)受體(AR和ER)的差異引起的。
　　在對前列腺癌和乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子FOXA1廣泛地參與AR和ER通路，影響腫瘤進程。在前列腺癌中，F(xiàn)OXA1影響AR對其下游基因的調(diào)控，F(xiàn)OXA1的高表達，與前列腺癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)顯著相關(guān);在乳腺癌中，ER對其下游基因的調(diào)控需要FOXA1的參與，F(xiàn)OXA1的高表達，預(yù)示更長的無病生存期和總生存期。那么，作為同

3、樣具有性別差異的肝癌來說，F(xiàn)OXA1是否也發(fā)揮著相同或相似的功能呢？
　　2012年，Li等人報道:用肝癌誘導(dǎo)藥物作用于Foxa1基因敲除的小鼠，原本不易誘發(fā)肝癌的雌性小鼠變得容易罹患肝癌，而雄性小鼠卻不易誘發(fā)肝癌，從而第一次證明FOXA1在肝癌發(fā)生及性別差異中發(fā)揮了舉足輕重的作用，其功能或表達水平異常會嚴重影響肝臟的正常生理功能。
　　基于前人的研究結(jié)果，本論文從FXA1基因變異和調(diào)控異常兩個方面著手，對FOXA1與肝癌發(fā)

4、生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移機制進行了探討。
　　第一章 FOXA1基因變異與肝癌易感性的關(guān)聯(lián)及其機制研究
　　肝癌的發(fā)生是內(nèi)因、外因共同作用的結(jié)果。遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn):個體是否患肝癌在很大程度上取決于個體的遺傳易感性。對肝癌患者及其親屬的研究表明:遺傳因素與肝癌的發(fā)生具有顯著的關(guān)聯(lián)。找到與遺傳易感性相關(guān)的基因或基因變異，并發(fā)現(xiàn)其導(dǎo)致肝癌發(fā)生的機制，對于肝癌的防治具有重要意義。
　　我們前期的關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn):FOXA1基因編碼區(qū)第247位

5、堿基多態(tài)性(rs7144658，A247G，Thr83Ala)與肝癌易感性顯著相關(guān)(P＜0.05)。為了從生物學(xué)角度解釋關(guān)聯(lián)的結(jié)果，我們借助ChIP-qPCR和報告基因?qū)嶒灥燃夹g(shù)手段開展了FOXA1基因變異增加肝癌易感性的機制研究。實驗結(jié)果顯示:OXA1基因編碼區(qū)第247位堿基由A變異為G后，其與靶基因啟動子區(qū)的結(jié)合能力顯著降低（P＜0.05），從而影響FOXA1調(diào)控的靶基因的表達水平，增加FOXA1/+247G基因型攜帶者的肝癌易感性

6、。
　　本章的主要內(nèi)容如下:
　　1.FOXA1基因編碼區(qū)第247位堿基A/G多態(tài)性與肝癌易感性顯著相關(guān)。基于本室前期的樣本-對照分析研究發(fā)現(xiàn):FOXA1基因編碼區(qū)第247位堿基多態(tài)性(rs7144658，A247G，Thr83Ala)與肝癌易感性顯著相關(guān)（P＜0.05），SNP+247A＞G的A/G及G/G基因型比A/A基因型顯著增加肝癌的患病風險(P＜0.05; OR,1.35;95％CI,1.09-1.67)。

7、　　2.FOXA1基因編碼區(qū)第247位堿基A到G變異減弱FOXA1與靶基因啟動子區(qū)的結(jié)合能力。在HepG2細胞中分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-FOXA1/247A和pcDNA3.1-FOXA1/247G后，開展ChIP-qPCR實驗。實驗結(jié)果證實:FOXA1/247G對其調(diào)控基因（如DIO1、UGT2B17、p27Kip1和NTCP）的啟動子區(qū)的結(jié)合能力顯著低于FOXA1/247A(P＜0.05)。
　　3.FOXA1基因編碼區(qū)第24

8、7位堿基A到G變異影響FOXA1的轉(zhuǎn)錄激活能力。通過對DIO1、UGT2B17、p27Kip1和NTCP的報告基因?qū)嶒?，我們證實:FOXA1/247G對DIO1和UGT2B17的轉(zhuǎn)錄激活能力低于FOXA1/247A，對p27Kip1的轉(zhuǎn)錄激活能力高于FOXA1/247A，而對NTCP的轉(zhuǎn)錄激活能力沒有明顯差別，說明該位點變異會影響FOXA1對其靶基因的轉(zhuǎn)錄激活能力。
　　4.肝癌組織樣本中FOXA1基因編碼區(qū)第247位堿基多態(tài)性影

9、響靶基因表達水平。為了從組織水平驗證我們的結(jié)論，我們對97例外科手術(shù)切除的肝癌組織進行了基因分型，其中67例為A/A基因型，27例為A/G基因型，3例為G/G基因型。隨后我們分別檢測了這些組織中DIO1、UGT2B17、p27Kip1和NTCP基因的mRNA水平。在A/G和G/G基因型組織樣本中，DIO1基因（P＜0.05）和UGT2B17（P＜0.05）基因表達水平均顯著低于A/A基因型組織樣本，p27Kip1基因（P＜0.0001）

10、表達水平顯著高于A/A基因型組織樣本，NTCP基因表達水平?jīng)]有顯著差異，以上結(jié)果與報告基因結(jié)果完全一致。
　　5.ER影響FOXA1與基因組DNA的結(jié)合能力，且對FOXA1/247A和FOXA1/247G的影響程度不同。ER雖然不影響FOXA1結(jié)合到NTCP基因啟動子區(qū)的能力，但是卻能增強FOXA1蛋白結(jié)合到DIO1基因啟動子區(qū)的能力。對于UGT2B17和p27Kip1，ER能夠減弱FOXA1結(jié)合到他們的啟動子區(qū)，且對FOXA1/

11、247A的影響程度大于FOXA1/247G。
　　6.ER影響FOXA1的轉(zhuǎn)錄激活能力，且對FOXA1/247A和FOXA1/247G的影響程度不同。ER一方面可以增強FOXA1對DIO1、UGT2B17和NTCP基因的轉(zhuǎn)錄激活能力，擴大FOXA1/247A與FOXA1/247G對DIO1轉(zhuǎn)錄激活能力的差異，另一方面可以減弱FOXA1對p27Kip1的轉(zhuǎn)錄激活能力，消除FOXA1/247A與FOXA1/247G對p27Kip1基因

12、轉(zhuǎn)錄激活能力的差異。
　　7.FOXA1基因編碼區(qū)第247位堿基A到G變異減弱FOXA1與ER的親和能力。在HepG2細胞中分別過表達FOXA1/247A和FOXA1/247G后，我們通過Co-IP實驗不僅驗證了FOXA1與ER存在相互作用，還發(fā)現(xiàn)FOXA1/247G與ER的親和力約為FOXA1/247A的40％，這從一定程度上解釋了先前的實驗結(jié)果。
　　FOXA1作為肝臟核因子之一，在維持肝臟正常功能中發(fā)揮著不可替代的作用

13、，其基因變異所引起的轉(zhuǎn)錄功能異常會影響肝臟的正常生理功能，從而增加機體患癌的風險。
　　FOXA1在肝癌發(fā)生中起到抑癌作用還是促癌作用目前還沒有定論，科學(xué)界普遍傾向于它是一個抑癌因子，其功能異常會增加機體患癌的風險。我們的研究結(jié)果也支持“FOXA1是一個抑肝癌因子”的結(jié)論，其基因編碼區(qū)第247位堿基A→G變異，會降低FOXA1結(jié)合其調(diào)控基因啟動子區(qū)的能力，引起下游基因在轉(zhuǎn)錄水平上的變化，這些基因表達水平的變化勢必會影響到肝臟的正常

14、功能，使機體長期處于一種“亞健康狀態(tài)”，減弱機體抵抗內(nèi)在及外在致癌因素的能力，從而增加個體罹患肝癌的風險。
　　第二章 FOXA1介導(dǎo)WT1促肝癌轉(zhuǎn)移機制研究
　　肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是肝癌致死的最主要原因，也是臨床肝癌治療和預(yù)防的最大挑戰(zhàn)。肝癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是一個多步驟形成、多基因參與并不斷變化的過程，與肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)的分子標志物和治療靶標也非常的復(fù)雜多樣。因此，找到與肝癌轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)的基因并發(fā)現(xiàn)其導(dǎo)致肝癌轉(zhuǎn)移的機制，對于肝癌

15、的治療具有重要意義。
　　在本部分研究中，我們發(fā)現(xiàn)FOXA1基因的表達受到WT1的調(diào)控，并通過實驗證明:WT1在肝癌細胞中的過量表達會使FOXA1的表達長期處于較高的水平，F(xiàn)OXA1表達量的變化，又使其對下游基因（如AFP、AGR2、p27Kip1等）的調(diào)控發(fā)生異常，最終促進肝癌的轉(zhuǎn)移能力。
　　本章的主要研究內(nèi)容如下:
　　1.WT1、FOXA1、AGR2蛋白表達量與肝癌轉(zhuǎn)移能力正相關(guān)。在對不同侵襲能力的肝/肝癌細胞

16、系蛋白表達水平檢測中，我們發(fā)現(xiàn):WT1、FOXA1、AGR2蛋白表達水平均隨肝癌細胞侵襲能力增加而增加，并呈現(xiàn)顯著的一致性。侵襲能力最強的MHCC97H細胞中具有最高的蛋白表達水平，侵襲能力稍弱的MHCC97L細胞中，蛋白表達水平有所降低，在其他侵襲能力較弱甚至無侵襲能力的細胞系（L02、Chang's、HepG2、Hep3B和Huh7）中表達水平顯著降低甚至檢測不到他們的表達。
　　2.WT1正調(diào)控FOXA1的表達。在過表達WT

17、1不同剪接體的HepG2細胞中，除了WT1-1組，其他三組中FOXA1的蛋白表達水平均顯著升高。經(jīng)報告基因?qū)嶒炞C實:WT1可以上調(diào)FOXA1的表達水平。隨后，我們以不同濃度的pcDNA3.1-WT1-4質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，結(jié)果顯示:FOXA1及AGR2熒光素酶活性隨著WT1轉(zhuǎn)染質(zhì)粒濃度的增加而呈現(xiàn)遞增的趨勢。
　　3.WT1不影響細胞的增殖能力，但其剪切體WT1-4可以顯著增強HepG2細胞的增殖能力。在MHC

18、C97H細胞中下調(diào)WT1的表達后，細胞的增殖能力沒有明顯的變化，說明WT1并不影響細胞的增殖能力。但是在HepG2細胞中分別過表達WT1剪接體WT1-1和WT1-4后，WT1-1組細胞增殖能力沒有明顯變化，而WT1-4組細胞增殖能力顯著上升。細胞周期實驗證實:WT1-4可以使HepG2細胞更多的處于G2/M期而進入細胞增殖分裂程序。以上結(jié)果說明:從整體水平上看，WT1不影響肝癌細胞的增殖能力，但是WT1第四種剪接體WT1-4具有促進肝癌

19、細胞增殖的功能。
　　4.WT1促進肝癌細胞的體外遷移能力。在MHCC97H細胞中下調(diào)WT1的表達，細胞的遷移能力受到明顯地抑制。在HepG2細胞中分別過表達WT1的剪接體WT1-1和WT1-4后，WT1-1組細胞的遷移能力沒有明顯變化，而WT1-4組細胞的遷移能力顯著上升，說明WT1能夠促進肝癌細胞的體外遷移能力，而其促進肝癌細胞的體外遷移能力可能是通過WT1-4來實現(xiàn)的。
　　5.WT1促進肝癌細胞的體外侵襲能力。在MH

20、CC97H細胞中下調(diào)WT1的表達后，細胞的侵襲能力受到明顯地抑制。在HepG2細胞中分別過表達WT1的剪接體WT1-1和WT1-4后，WT1-1組細胞的侵襲能力沒有明顯變化，而WT1-4組細胞的侵襲能力顯著上升，說明WT1能夠促進肝癌細胞的體外侵襲能力，而其促進肝癌細胞的體外侵襲能力可能是通過WT1-4來實現(xiàn)的。
　　本章研究發(fā)現(xiàn):WT1可以正調(diào)控FOXA1基因的表達，進而影響AGR2等FOXA1下游基因的表達水平，促進肝癌的轉(zhuǎn)移