人腸道細(xì)菌Feacalibacterium prausnitzii數(shù)量和組成的研究方法的建立和應(yīng)用.pdf

1、腸道菌群是人體內(nèi)最復(fù)雜的共生微生物生態(tài)系統(tǒng)，無論是健康或疾病狀態(tài)下，人體生理代謝都不可避免地受到腸道菌群結(jié)構(gòu)變化的影響。
　　Feacalibacterium prausnitzii是人腸道中數(shù)量最占優(yōu)勢的細(xì)菌之一，占細(xì)菌總數(shù)的7％以上，并在人群中廣泛分布。腸道細(xì)菌F. prausnitzii具有重要的生理功能：能夠?yàn)槟c上皮細(xì)胞提供能量；可以影響宿主多個(gè)代謝通路；可能通過甲胺類物質(zhì)的代謝與胰島素抵抗相關(guān)；具有抗腸道炎癥的特性。但是

2、該種菌嚴(yán)格厭氧且難于培養(yǎng)，因此，使用分子方法對(duì)該細(xì)菌在中國人群中的數(shù)量和組成進(jìn)行分析，對(duì)解析F.prausnitzii與人體健康和疾病的關(guān)系具有重要的意義。
　　本研究首先比較3對(duì)基于16S rRNA基因、用于檢測F.prausnitzii的引物（FPR-1-FPR-2、FPR-2F-Fprau645R和Fprau223F-Fprau420R）的特異性，選取特異性最好的1對(duì)用于后續(xù)定量和組成的研究。用Clustal X比對(duì)每個(gè)引物

3、與F.prausnitzii和其他細(xì)菌的16S rRNA基因的序列。在Ribosomal Database Project（RDP）數(shù)據(jù)庫中使用Probe Match工具比較每個(gè)引物匹配的Faecalibacterium spp.序列數(shù)目。利用本課題組建立的中國人糞便菌群的16S rRNA基因全長文庫的7255個(gè)克隆序列，用Simulated PCR（SPCR）預(yù)測每對(duì)引物檢測到的F.prausnitzii和其他細(xì)菌的克隆數(shù)；用3對(duì)引物

4、分別對(duì)代表克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示：引物Fprau645R的3’端最后一個(gè)堿基與非F.prausnitzii序列的錯(cuò)配度高于其它引物，它在RDP中匹配的Faecalibacterium spp.序列數(shù)占其匹配的細(xì)菌序列數(shù)的百分比（97.6%）顯著高于其他引物。SPCR預(yù)測，3對(duì)引物檢測到的F. prausnitzii克隆數(shù)均為1171左右；在檢測到的非Faecalibacterium spp.克隆中，F(xiàn)PR-2F-Fprau645R

5、主要是Subdoligranulum spp.，而FPR-1-FPR-2和Fprau223F-Fprau420R還有Oscillibacter spp.、Ruminococcus spp.和unclassified Ruminococcaceae等。真實(shí)PCR與SPCR的結(jié)果吻合。結(jié)果表明3對(duì)引物能檢測到F.prausnitzii和Subdoligranulum spp.，F(xiàn)PR-2F-Fprau645R的特異性優(yōu)于FPR-1-FPR-

6、2和Fprau223F-Fprau420R。
　　接著，運(yùn)用FPR-2F-Fprau645R這對(duì)引物，我們摸索了F.prausnitzii特異性的實(shí)時(shí)定量PCR方法，并建立了F.prausnitzii特異性的變性梯度凝膠電泳（DGGE）的分析方法，并用這兩種方法調(diào)查了56個(gè)單純性肥胖和57個(gè)正常體重成人（年齡、性別、居住地一一匹配，其中女性63人，男性50人）糞便中F.prausnitzii的數(shù)量和組成。
　　F.praus

7、nitzii特異性實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，女性腸道中F.prausnitzii的數(shù)量顯著高于男性（P=0.005），其中在正常體重組，得到的結(jié)果同上，而在肥胖組并沒有得到上述性別間的差異，提示F.prausnitzii在不同性別間存在數(shù)量差異。糞便F.prausnitzii的數(shù)量與體質(zhì)指數(shù)（BMI）相關(guān)（R=0.214，P=0.023），提示F.prausnitzii與肥胖可能存在一定的關(guān)系。相比于正常體重志愿者，肥胖志愿者腸道中F.p

8、rausnitzii的數(shù)量較多，但是差異并不顯著（P=0.101）。
　　F.prausnitzii類群特異性的PCR-DGGE方法對(duì)14個(gè)肥胖個(gè)體和13個(gè)正常體重對(duì)照個(gè)體進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)兩組人群的F.prausnitzii的組成沒有明顯的差異。
　　綜上所述，F(xiàn)PR-2F-Fprau645R是檢測糞便F.prausnitzii的特異性較好的引物。人糞便F.prausnitzii的數(shù)量具有性別差異，并與肥胖具有一定的關(guān)系。本