抑制ISL1的表達對胃癌細胞特性影響的研究.pdf

1、胃癌是目前世界范圍內最常見的消化道惡性腫瘤,其具有發(fā)病率高、死亡率高、早期診斷率較低,生存率低等特點。有許多研究表明,胃癌存在基因的表達異常,如 P15、P53、FHIT、CD44等,但這些對于研究胃癌細胞特性及其耐藥性方面還遠遠不夠。ISL1(胰島素基因增強結合蛋白1)為轉錄調節(jié)因子——Islet-1,其對胰島細胞成熟、增殖和分化都具有重要作用。我們前期有研究,通過高通量的實驗技術,發(fā)現ISL1在胃癌側群細胞中高表達。我們用 RNA干

2、擾的方法抑制 ISL1在胃癌BGC823中的表達,來檢測胃癌細胞的特性發(fā)生何種變化,為胃癌的治療提供更好的理論依據。
　　第一部分下調 ISL1的表達對胃癌BGC823特性的影響
　　目的:
　　構建針對人胰島素基因增強結合蛋白1(ISL1)的小干擾 RNA,將小干擾RNA轉染進BGC823細胞中,下調ISL1的表達,來檢測胃癌細胞特性的變化。
　　方法:
　　從NCBI數據庫中獲取人ISL1基因編碼序列全

3、長,利用siRNA設計軟件設計1對干涉靶點和隨機的不靶向任何基因的陰性對照。將小干擾RNA轉染體外培養(yǎng)的人胃癌細胞系 BGC823,逆轉錄酶鏈式反應(RT-PCR)和免疫印跡法(Western-blotting)等生物化學技術,檢測ISL1基因的mRNA和蛋白表達水平的變化。并用MTT比色法測定細胞增殖。用CCK-8法檢測細胞對化療藥物的敏感性。
　　結果:
　　1小干擾RNA序列:
　　ISL1-siRNA序列為:5

4、’-GCUCCAAGGUGUAUCACAUTT-3’(正義)5’-AUGUGAUACACCUUGGAG-3’(反義)。
　　陰性對照序列為:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(正義)5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(反義)。
　　GAPDH陽性對照序列為:5’-GUAUDACAACAGCCUCAAGTT-3’(正義)5’-CUUGAGGCUGUUGUCAUACTT-3’(反義)。

5、r>　　2測定轉染后ISL1基因在胃癌BGC823細胞中mRNA及蛋白表達情況。
　　2.1 ISL1mRNA在胃癌BGC823細胞中表達下降。
　　經半定量RT-PCR分析,ISL1siRNA下調ISL1 mRNA的表達,使其表達明顯減少。經過ISL1siRNA轉染BGC823細胞24h后與空白對照組相比,ISL1 mRNA表達水平分別為(0.658±0.032)和(1.371±0.022),差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.0

6、5)。
　　2.2 ISL1蛋白在胃癌BGC823細胞中表達下降
　　經 Western-Blot檢測 ISL1蛋白發(fā)現,經過 ISL1siRNA轉染48h后與空白及陰性對照組相比, ISL1siRNA組 ISL1蛋白表達水平(0.900±0.133)較空白組(1.710±0.150)及陰性對照組(1.630±0.126)減少,相比具有顯著性差異(P<0.05)。
　　3 MTT比色法測定細胞的增殖
　　通過檢測

7、各組細胞各個時間點的OD值,以培養(yǎng)時間為X軸,對應的OD值為Y軸,得出細胞生長曲線,結果表明siRNA-BGC823細胞的體外增殖能力明顯低于其余兩組細胞,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　4 CCK-8法檢測細胞對化療藥物的敏感性
　　經過PTX、5-Fu、VP-16三種藥物分別作用48h后,BGC823細胞的耐藥存活率分別為44％、57%、61%;而siRNA-BGC823細胞的耐藥存活率分別為26%、39%、43

8、%。結果表明, siRNA-BGC823細胞對化療藥物的敏感性明顯高于BGC823細胞(P<0.05)。
　　結論:
　　構建針對人ISL1的siRNA,成功轉染胃癌BGC823細胞,經鑒定能明顯抑制 ISL1mRNA及蛋白的表達。ISL1表達下調可明顯抑制胃癌BGC823細胞的生長增殖速度,并增強其對化療藥物的敏感性。表明ISL1基因對胃癌細胞的生長增殖及耐藥性方面有著重要影響。
　　第二部分富集BGC823側群細胞

9、,觀察下調ISL1對其特性的影響
　　目的:
　　用無血清懸浮培養(yǎng)法分離 BGC823中的側群細胞,檢測 BGC823細胞及其側群細胞在增殖及藥物敏感性方面的變化。將小干擾RNA轉染至BGC823-SP細胞,下調ISL1的表達,來觀察胃癌干細胞特性的變化。
　　方法:
　　無血清懸浮培養(yǎng)法富集 BGC823側群細胞,用 MTT法及 CCK-8法檢測其在增殖及藥物敏感性方面的變化。將小干擾 RNA轉染至BGC823

10、-SP細胞,逆轉錄酶鏈式反應( RT-PCR)和免疫印跡法(Western-blotting)等生物化學技術,檢測ISL1基因的mRNA和蛋白表達水平的變化。并用MTT比色法檢測細胞增殖。用CCK-8法檢測細胞對化療藥物的敏感性。
　　結果:
　　1成功富集BGC823側群細胞(BGC823-SP)
　　2 BGC823及BGC823-SP細胞的增殖速度及對化療藥物敏感性的對比
　　2.1 MTT比色法測定BGC

11、823及BGC823-SP細胞的細胞增殖的對比
　　通過檢測各組細胞各個時間點的OD值,以培養(yǎng)時間為X軸,對應的OD值為Y軸,得出細胞生長曲線,結果表明BGC823-SP細胞的體外增殖能力明顯強于BGC823細胞,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　2.2 CCK-8法測定BGC823及BGC823-SP細胞對化療藥物的敏感性
　　經過PTX、5-Fu、VP-16三種藥物分別作用48h后,BGC823細胞的耐藥存活

12、率分別為44%、57%、61%;而 BGC823-SP細胞的耐藥存活率分別為56%、67%、70%。結果表明,BGC823-SP細胞對化療藥物的敏感性明顯低于BGC823細胞(P<0.05)。
　　3測定siRNA轉染后ISL1基因在胃癌BGC823-SP細胞中mRNA及蛋白表達情況。
　　3.1 ISL1mRNA在胃癌BGC823-SP細胞中表達下降。
　　經半定量RT-PCR分析,ISL1siRNA下調ISL1 m

13、RNA的表達,使其表達明顯減少。經過ISL1siRNA轉染BGC823細胞24h后與空白對照組相比,ISL1 mRNA表達水平分別為(0.403±0.001)和(1.428±0.302),差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　3.2 ISL1蛋白在胃癌BGC823-SP細胞中表達下降。
　　經Western-Blot檢測ISL1蛋白發(fā)現,經過ISL1siRNA轉染48h后與空白及陰性對照組相比,ISL1siRNA組ISL

14、1蛋白表達水平(0.592±0.187)較空白組(1.847±0.193)及陰性對照組(1.700±0.165)減少,相比具有顯著性差異(P<0.05)。
　　4 MTT比色法測定細胞的增殖
　　通過檢測各組細胞各個時間點的OD值,以培養(yǎng)時間為X軸,對應的OD值為Y軸,得出細胞生長曲線,結果表明siRNA-BGC823-SP細胞的體外增殖能力明顯弱于 BGC823-SP細胞,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　5

15、CCK-8測定細胞對化療藥物的敏感性
　　經過 PTX、5-Fu、VP-16三種藥物分別作用48h后,BGC823-SP細胞的耐藥存活率分別為56%、67%、70%;而siRNA-BGC823-SP細胞的耐藥存活率分別為20%、31%、33%。結果表明, siRNA-BGC823-SP細胞對化療藥物的敏感性明顯高于BGC823-SP細胞(P<0.05)。
　　結論:
　　胃癌 BGC823-SP細胞的體外增殖能力及其耐