糖尿病來源的骨髓間充質干細胞治療心肌梗死的相關研究.pdf

1、目的：
　　骨髓間充質干細胞（MSC）治療心肌梗死（MI）是 MI治療可選擇的治療手段之一，MSC可以通過旁分泌機制分泌多種細胞因子，發(fā)揮其抑制凋亡、促進血管新生、調節(jié)心室重塑、改善心臟功能的作用。與MSC移植治療MI的動物實驗不同，其臨床試驗的效果并不確切。其原因可能是臨床患者常合并其他疾病，如糖尿病等。目前關于糖尿病人的MSC的生物學特性及其基因表達差異尚無報道。本研究的目的是比較糖尿病來源與非糖尿病來源的MSC在基因表達方面

2、存在的差異，及其在治療心肌梗死方面的差異，發(fā)現(xiàn)可能引起這些差異的關鍵細胞因子（Bcl-2、Bcl-xL），并驗證通過MSC修飾Bcl-xL是否可以增加MSC的存活率、改善心臟功能。
　　方法：
　　本實驗通過Affymetrix全基因組基因芯片技術進行MSC功能基因表達譜分析，以期發(fā)現(xiàn)冠心病合并糖尿?。–AD+DM）患者與冠心病非糖尿?。–AD）患者MSC基因表達的差異。并通過慢病毒轉染基因修飾MSC的方式研究hBcl-xL

3、在增加MSC在心肌梗死區(qū)域存活率、促進血管新生、抑制凋亡、改善心臟功能等方面的作用。主要內(nèi)容包括三部分：
　　1、冠狀動脈旁路移植（CABG）術中獲取患者骨髓，體外擴增MSC，收集第3代細胞進行流式細胞儀篩選鑒定、繪制生長曲線、提取RNA制作基因芯片、比較基因表達差異。
　　2、CAD+DM與CAD患者MSC移植到大鼠心肌梗死區(qū)域，觀察其對于心肌梗死的治療作用（抑制凋亡、改善心臟功能），以及Bcl-2、VEGF等表達情況。<

4、br>　　3、應用慢病毒載體轉染系統(tǒng)轉染hBcl-XL-IRES2-EGFP融合基因達到過表達，同時單獨轉IRES2-EGFP作為對照。通過熒光顯微鏡、WB方法驗證病毒轉染效率；流式細胞技術測定是否增強細胞抗凋亡的能力、ELISA測定MSC在低氧培養(yǎng)基上清中細胞因子變化，確定基因修飾后細胞分泌功能的變化。進而進行治療心肌梗死的動物實驗，觀察是否能夠提高MSC在梗死區(qū)的存活率、抑制梗死區(qū)域的細胞凋亡、減少瘢痕形成、促進血管新生、改善心臟功

5、能。
　　結果：
　　1、糖尿病患者來源的MSC具有MSC的生物學特性：表達CD29、CD44；不表達CD34、CD45，體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其增殖能力顯著低于非糖尿病患者來源的MSC；
　　2、Affymetrix基因芯片證實：CAD+DM組與CAD組MSC相比較，功能蛋白表達基因中涉及細胞凋亡、細胞因子、細胞內(nèi)信號傳導系統(tǒng)的基因有27個，其中13個基因表達明顯上調，分別為TNFRSF10B、TNFRSF21、NGF、CAV

6、2、ITGA8、TNS1、ITGA2、AKT3、MBP、MAP2、INHBA、FST、PLA2G5；有14個基因表達明顯下調EPR1、BIRC5HELLS、BCL2、HGF、CASP1、SEPP1、ITGA9、MAP2K6RUNX3、TGFBR2、RUNX2、CTNNB1、CDC42。
　　3、CAD+DM組與CAD組MSC細胞移植到大鼠心肌梗死邊緣區(qū)均能顯著抑制心肌細胞凋亡、改善心臟收縮功能，但CAD+DM組這些作用與CAD組相

7、比顯著降低，可能與CAD+DM組移植后Bcl-2表達顯著低于CAD組有關。
　　4、慢病毒可以安全、有效的轉染hBcl-xL-IRES-EGFP融合基因、IRES-EGFP融合基因到MSC內(nèi)，EGFP的共轉染可以確定轉染效率并測定后續(xù)動物實驗中MSC的存活率。研究顯示，病毒轉染未影響MSC的生物學特性，過表達hBcl-xL可以增加MSC分泌細胞因子和抗凋亡能力，Western Blot檢測、Annexin V/PI檢測、ELISA

8、檢測顯示，hBcl-xL基因修飾的MSC表達hBcl-xL顯著增加、抗凋亡能力增強、分泌VEGF、IGF-1、PDGF等細胞因子增加（p<0.05）。
　　5、hBcl-xL基因修飾的MSC移植治療心肌梗死的在體實驗提示：過表達hBcl-xL的MSC在移植區(qū)域的存活率提高、可以顯著降低梗死邊緣區(qū)心肌細胞凋亡、促進毛細血管新生、減少瘢痕組織形成、改善心臟功能（p<0.05）。
　　結論：
　　1、糖尿病來源的MSC在細胞

9、增殖等方面與非糖尿病來源的MSC存在顯著差異，兩者存在基因表達差異，其Bcl-2表達顯著降低；
　　2、糖尿病來源的MSC治療大鼠心肌梗死療效與非糖尿病來源的MSC相比顯著降低；
　　3、應用慢病毒轉染系統(tǒng)轉染使MSC高表達Bcl-xL后可以顯著提高MSC在低氧條件下的抗凋亡能力、顯著增加VEGF、IGF-1、PDGF等細胞因子的分泌。
　　4、高表達Bcl-xL的MSC移植到心肌梗死區(qū)域可以顯著提高MSC的存活率、抑