人源塵肺病噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建和初步鑒定.pdf

1、研究背景：
　　 塵肺病目前仍是中國職業(yè)病中發(fā)病率最高、死亡危險性較大、對勞動者危害最嚴(yán)重的一類,迄今尚無將其消除或逆轉(zhuǎn)的根治方法,只能根據(jù)病情進行綜合醫(yī)治以減輕癥狀、延緩病情進展,因此,積極預(yù)防并盡早診斷對于增進病人生存質(zhì)量及延長壽命尤為重要。迄今為止,國內(nèi)外已經(jīng)對塵肺病進行了大量的相關(guān)研究,但塵肺病的形成機制目前還不十分清楚,不僅塵肺病所致肺組織纖維化尚無消除或逆轉(zhuǎn)的根治方法,也缺乏接塵人群健康監(jiān)護、早期預(yù)警及塵肺病早期發(fā)現(xiàn)

2、的有效生物監(jiān)測指標(biāo),診斷仍然依靠達到一定病理程度后的X線表現(xiàn)。進一步探索塵肺病的發(fā)生、發(fā)展和演進過程,篩選和鑒定出能夠反映粉塵接觸、塵肺病進程的生物標(biāo)志,對解釋塵肺病發(fā)病分子機制、進行塵肺發(fā)病的早期預(yù)警和診斷以及研究阻止纖維化進展的干預(yù)靶點,都具有積極的意義和作用。
　　 目的：
　　 利用噬菌體抗體庫技術(shù),構(gòu)建人源塵肺病ScFv噬菌體單鏈抗體庫,為塵肺病生物標(biāo)記篩選打下基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 首先分

3、離塵肺病人外周血淋巴細(xì)胞,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,采用兼并引物利用半巢式PCR擴增抗體重鏈(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因。使用帶有粘端的Linker將VH和VL連接成單鏈抗體(ScFv)基因。
　　 將ScFv和噬菌粒載體pCANTAB-5E進行雙酶切后,將ScFv與pCANTAB-5E進行拼接,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌TG1,經(jīng)輔助噬菌體超感染,構(gòu)建了全人源塵肺噬菌體單鏈抗體庫,對抗體庫的庫容量與多樣性進行檢測。

4、
　　 結(jié)果：
　　 結(jié)果顯示:瓊脂糖電泳從塵肺病人外周血中提取的總RNA,可見明顯的28S和18S2條帶,提示總RNA無降解且完整性較好；VH片段大小為370bp左右,VL片段為320bp左右,組裝后ScFv基因片段(VH—Linke-VL)長度為750bp左右。
　　 涂板后隔夜培養(yǎng),初步估算抗體庫庫容量為2.4×107的噬菌體單鏈抗體庫。隨機挑取5個單克隆,質(zhì)粒雙酶切后顯示陽性插入率100％(5／5)。