乳腺癌人源噬菌體抗體庫的構(gòu)建及初步鑒定.pdf

1、乳腺癌(breast cancer)是女性常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有120萬婦女發(fā)生乳腺癌，有50萬婦女死于乳腺癌，發(fā)病率占全年各種惡性腫瘤的7％～10％。在我國，乳腺癌的發(fā)病率雖較西方國家為低，但近年來亦有上升趨勢(shì)。目前，以超聲及X線等為主的乳腺癌診斷方法，對(duì)早期乳腺癌的診斷尚缺乏足夠的準(zhǔn)確性和特異性。而以手術(shù)，化療及放療主的綜合治療又因副作用太大而在臨床應(yīng)用中受到諸多限制。因此，許多學(xué)者把目光投向了乳腺癌的抗體診斷及治療。

2、 近10年來，腫瘤的生物治療已經(jīng)作為一種重要的治療模式被廣泛的研究和應(yīng)用于臨床。但是，無論是早期利用腫瘤細(xì)胞免疫小鼠得到的多克隆抗體，還是以后運(yùn)用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的單克隆抗體都因?yàn)榭贵w的特異性低或者人抗鼠免疫反應(yīng)(human anti-murine antibodyresponse,HAMA)等原因而不適用于臨床腫瘤治療。直到1998年FDA正式批準(zhǔn)人源化鼠源單克隆抗體赫賽汀(Herceptin)應(yīng)用于臨床CerBb2受體陽性的乳腺

3、癌的治療，才為腫瘤的抗體治療帶來了新的挈機(jī)。但是在臨床使用中發(fā)現(xiàn)這種被寄予厚望的單克隆抗體僅能對(duì)30％的Her2/neu陽性的乳腺癌患者產(chǎn)生抗腫瘤效果。Micheu等認(rèn)為單克隆抗體分子量較大，組織穿透性差，使其在腫瘤部位的濃聚減少是Herceptin治療效果不甚理想的一個(gè)重要原因。 1985年Smith提出了噬菌體展示技術(shù)的概念及1990年Huse成功的構(gòu)建第一個(gè)噬菌體組合文庫為腫瘤的診斷及治療提供了一種全新的方法。噬菌體單鏈抗

4、體分子量較小、組織穿透性強(qiáng)、能夠迅速到達(dá)靶抗原部位，在腫瘤的診斷及治療中有很強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。但是，目前報(bào)道的抗乳腺癌噬菌體抗體庫多為鼠源性，因人抗鼠免疫反應(yīng)而不適合臨床運(yùn)用。針對(duì)鼠源性單鏈抗體的異源性問題我們嘗試?yán)萌橄侔┗颊甙┡粤馨图?xì)胞來構(gòu)建人源乳腺癌抗體文庫，并利用乳腺癌細(xì)胞株MCF-7進(jìn)行篩選。 目的：利用基因工程方法和噬菌體抗體庫技術(shù)構(gòu)建人源乳腺癌單鏈抗體文庫，并從中篩選出特異性的噬菌體單鏈抗體，為乳腺癌的免疫診斷及免疫治

5、療提供新載體。 方法與結(jié)果： 噬菌體抗體文庫的構(gòu)建： 1．人源單鏈抗體基因文庫的構(gòu)建：取乳腺癌患者癌旁淋巴結(jié)作為B細(xì)胞的來源，提取淋巴細(xì)胞的總RNA，通過RT-PCR的方法分別擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)(V<,H>)和抗體輕鏈可變區(qū)(V<,L>)基因片斷。再以VH和VL基因片斷為模板分別擴(kuò)增 V<,H>-linker與V<,L>-linker，然后利用SOE-PCR技術(shù)將他們拼接成完整的單鏈抗體(scfv)基因片斷。最后

6、，在抗體基因片斷的兩端引入酶切位點(diǎn)SfiI和NotI。結(jié)果顯示：從乳腺癌癌旁淋巴結(jié)中提取的總RNA在瓊脂糖電泳結(jié)果中可見明顯的28S和18S條帶；V<,H>基因片斷的大小約350bp和V<,L>基因片斷的大小約300bp；組裝后的Scfv基因片段約750bp。 2．噬菌體單鏈抗體庫與噬菌體載體pCANTAB-5E的拼接：制備轉(zhuǎn)化效率達(dá)到6.5×10<'7>cfu/ug PUC18的高濃度電轉(zhuǎn)菌 TG1。單鏈抗體基因片斷經(jīng)SfiI

7、和NofI雙酶切后，電轉(zhuǎn)感受態(tài)大腸桿菌TG1，結(jié)果獲得4.2×10<'7> cfu/ug氨芐青霉素抗性克隆。隨即進(jìn)行酶切反應(yīng)鑒定，陽信插入率為79％(19/24)。隨即測(cè)序結(jié)果證實(shí)抗體重鏈和輕鏈以整碼的單鏈抗體方式準(zhǔn)確的插入了載體。 噬菌體抗體文庫的初步篩選： 1．利用正常的人成纖維細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞MCF-7對(duì)抗體庫進(jìn)行富集篩選：先以正常人成纖維細(xì)胞對(duì)抗體庫進(jìn)行負(fù)性篩選，然后再利用MCF-7對(duì)抗體庫進(jìn)行富集，共進(jìn)行了5輪

8、“吸附-洗脫-擴(kuò)增”富集篩選。得到一個(gè)4.2×10<'7>的噬菌體抗體庫，說明特異性的scFv得到了有效富集。 2．噬菌體scfv的ELISA鑒定：對(duì)第五輪后的噬菌體抗體隨即進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示：3/12的克隆呈陽性反應(yīng)。 結(jié)論：針對(duì)鼠源性單鏈抗體在臨床應(yīng)用中存在的人抗鼠免疫反應(yīng)的問題，我們嘗試?yán)檬删w抗體庫技術(shù)構(gòu)建乳腺癌相關(guān)人源單鏈抗體庫，并利用乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行初步篩選。結(jié)果表明通過噬菌體抗體庫技術(shù)可以直接從腫