食管癌人源噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建與初步篩選.pdf

1、食管癌(esophagealcancer)是人類常見的一種消化道腫瘤，分別占我國和世界惡性腫瘤發(fā)病的第四位和第七位。世界上70％的食管癌發(fā)生在我國，我國是世界上食管癌死亡率最高的國家之一。食管癌患者的五年生存率始終徘徊在10％左右，仍然嚴(yán)重威脅著人民的生命和健康。食管癌的治療以外科根治性手術(shù)為主，但對(duì)于手術(shù)不能切除的晚期腫瘤和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的腫瘤臨床尚無有效的治療手段，而腫瘤的導(dǎo)向治療可以達(dá)到特異地殺傷癌細(xì)胞，并盡可能降低對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用

2、，提高抗腫瘤的療效。近10余年來，腫瘤的生物治療已作為一種重要的治療模式被廣泛研究和應(yīng)用于臨床?？贵w介導(dǎo)的腫瘤免疫顯像和免疫治療是生物治療的重要組成部分，對(duì)腫瘤及其轉(zhuǎn)移的診斷、精確的分期和治療方案的確定均有重要意義。 自1975年Kohler和Milstein成功的制備第一株單克隆抗體以來，單抗的研究經(jīng)歷了鼠源性抗體人源化改造、小分子抗體和抗體展示文庫三個(gè)研究階段。其中抗體文庫的出現(xiàn)將基因工程抗體的發(fā)展推向了高潮。 針對(duì)

3、鼠源性單克隆抗體在臨床應(yīng)用中經(jīng)常發(fā)生的異源性問題和導(dǎo)向治療中大分子抗體存在的穿透力較差的問題，我們嘗試應(yīng)用噬菌體抗體庫技術(shù)構(gòu)建食管癌相關(guān)的人源單鏈抗體文庫，并用食管癌細(xì)胞對(duì)抗體文庫進(jìn)行了初步篩選。 目的：用基因工程方法和噬菌體抗體庫技術(shù)構(gòu)建人源食管癌單鏈抗體庫，并從中篩選出特異性的單鏈抗體，為食管癌的免疫診斷及免疫治療提供新載體。 方法與結(jié)果： 噬菌體抗體文庫的構(gòu)建：L人源單鏈抗體基因文庫的構(gòu)建：取食管癌病人癌腫

4、周圍淋巴結(jié)作為B細(xì)胞的來源，提取淋巴結(jié)的總RNA。設(shè)計(jì)簡并引物，用RT一PCR的方法分別擴(kuò)增抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因eDNA文庫。首先分別網(wǎng)格篩選確定擴(kuò)增VH和VL基因片斷的引物對(duì)，以cDNA為模板擴(kuò)增VH和VL基因片斷，再以VH和VL基因片斷為模板分別擴(kuò)增VH—linker與VL-1inker，然后用SOE—PCR技術(shù)將它們拼接后引入酶切位點(diǎn)SfiI和Not工，膠回收PCR產(chǎn)物即得到ScFv基因。結(jié)果顯示：食管癌周圍淋巴結(jié)總RNA的提

5、取瓊脂糖電泳結(jié)果中可見清晰的28S、18S條帶；擴(kuò)增VH的引物對(duì)為HuJH3FOR與HuVN5aBACK；擴(kuò)增VL的引物對(duì)為HuVK5aBACK與HuJK2FOR；擴(kuò)增VH-1inker的引物對(duì)為HuJH4-5Linker與HuVN5aBACK，擴(kuò)增VL—linker的引物對(duì)為HuJK2FOR與Linker-HuVK2-3-6BACK；引入酶切位點(diǎn)的引物為HuJK2FORNot與HuVH5aBACKSfi。Vn基因的大小約為450bp，

6、VL基因?yàn)?50bp，組裝后的ScFv基因約為850bp。2．單鏈抗體基因文庫與噬菌體載體pCANTAB-5E的拼接：制備轉(zhuǎn)化效率達(dá)到108cfu／ugpUCl8DNA的高濃度電轉(zhuǎn)菌TGi。單鏈抗體PCR產(chǎn)物經(jīng)SfiI和NotI雙酶切后，膠純化回收。酶切產(chǎn)物與噬菌粒載體pCANTAB-5E連接反應(yīng)后，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGi，結(jié)果獲得2×10?cfu／ug氨芐青霉素抗性克隆。隨機(jī)進(jìn)行酶切反應(yīng)鑒定，陽性插入率為9L7％(22／24)。隨機(jī)測序

7、結(jié)果證實(shí)抗體重鏈和輕鏈以整碼的單鏈抗體方式準(zhǔn)確插入了載體。3．噬菌體抗體的展示：用2一YT染，在無糖環(huán)境下誘導(dǎo)單鏈抗體片段的噬菌體展示。重組噬菌體的滴度達(dá)到10¨cfu／ml。 對(duì)噬菌體抗體庫進(jìn)行初步的篩選及鑒定：L食管癌細(xì)胞株對(duì)抗體庫的富集：先以懸浮狀態(tài)的正常人食管上皮細(xì)胞篩選后再用食管癌細(xì)胞Eca1.00和噬菌體抗體庫進(jìn)行了親和富集，對(duì)4輪富集后的噬菌體抗體隨機(jī)進(jìn)行了ELISA檢測，結(jié)果顯示：30／85的克隆呈陽性反應(yīng)。第一

8、輪噬菌體收獲率％為1．15×10一，第四輪噬菌體收獲率％為1．62×10～，第四輪噬菌體收獲率是第一輪的141倍。2．表達(dá)可溶性ScFv抗體：強(qiáng)陽性重組噬菌體克隆感染E．coliHB2151，經(jīng)lmmIPTG誘導(dǎo)表達(dá)可溶性ScFv抗體。3．親和柱層析純化可溶性抗體：將上述可溶性抗體過HiTrapTMAnti—ETag柱進(jìn)行親和柱層析，先用中性緩沖洗去未結(jié)合抗體，再用酸性緩沖洗脫結(jié)合的目的抗體并用堿性緩沖中和，用Azs。檢測，合并峰值高的

9、溶液，進(jìn)行蛋白定量。4．SDS—PAGE：用12％的分離膠及5％濃縮膠的SDS—PAGE測定上述純化的可溶性抗體分子量的大小，結(jié)果顯示分子量為30KD左右。5．Western-blot：免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明HRP／anti-Mi3單克隆抗體能使一條分子量為30KD左右的條帶染色。6．免疫組織化學(xué)結(jié)果提示可溶性抗體僅染食管癌組織，而其它癌組織不染色。7．免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果表明此可溶性抗體可使食管癌細(xì)胞Ecal09染色。8．用細(xì)胞ELISA測定可

10、溶性抗體的免疫活性：Eca1.00~osnm為0．73_+0．n，胃癌BGc-823的為0．23+0．08，正常食管上皮細(xì)胞(NHEEC)為0．254-0．06，結(jié)果顯示可溶性抗體具有較高的特異性，能與Eca1.00細(xì)胞結(jié)合，而不與胃癌BGc-823和NHEEC結(jié)合。結(jié)論：針對(duì)鼠源性單克隆抗體在臨床應(yīng)用中經(jīng)常發(fā)生的異源性問題，我們嘗試應(yīng)用噬菌體抗體庫技術(shù)構(gòu)建食管癌相關(guān)的人源單鏈抗體文庫，并用食管癌細(xì)胞抗原對(duì)抗體文庫進(jìn)行了初步篩選。結(jié)果表