稻瘟病菌兩個致病相關基因ZNF1和CKS1的鑒定及生物學功能分析.pdf

1、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病(rice blast)是水稻上的重要病害，每年可造成10-30％的稻谷產量損失，嚴重威脅世界水稻種植和糧食安全。由于經(jīng)濟的重要性和分子遺傳的可操作性，稻瘟病菌-水稻互作機制已成為研究病原菌-寄主植物互作的模式系統(tǒng)。對稻瘟病菌致病分子機理的深入了解不僅有利于病害防治策略的研發(fā)，而且對其它植物病原真菌致病機理的認識具有指導意義。本文通過農桿菌介導的T-DNA轉化和生物信息學分析鑒

2、定了2個稻瘟病菌致病相關基因:ZNF1和CKS1。通過基因敲除、表型分析、熒光標記、酵母雙雜交等分子生物學技術分析了ZNF1和CKS1在稻瘟病菌形態(tài)發(fā)育和致病過程中的作用，主要研究結果如下:
　　1.建立了T-DNA插入突變體庫，獲得了XF696等5個致病缺陷突變體
　　為獲得與稻瘟病菌致病相關新基因，本實驗進行了三次ATMT轉化，共獲得2200個T-DNA插入突變體。其中5個突變體(XF577，XF696，XF1379，X

3、F1521，XF1557)對寄主的致病性完全喪失。Tail-PCR以及生物信息學分析明確了5個突變體的T-DNA標記基因分別為BUF1(MGG_02252)，MGG_14931，STU1(MGG_00692),MKK2(MGG_06482),MST12(MGG_12958)。其中XF696的T-DNA標記基因MGG_14931的生物學功能尚未報道。
　　2.ZNF1在稻瘟病菌附著胞發(fā)育、成熟以及侵染過程中有重要作用
　　XF

4、696突變體中T-DNA標記基因MGG14931編碼一個假定的C2H2鋅指蛋白，將該基因命名為ZNF1(Maganporthe oryzaezinc finger protein)。ZNF1基因的轉錄產物有兩種不同的剪切形式:SⅠ和SⅡ，SⅠ為主要剪切方式，并具有正常功能，而SⅡ沒有功能?；蚯贸?、互補、表型分析及qRT-PCR等實驗結果表明:1)敲除ZNF1不影響稻瘟病菌營養(yǎng)生長、色素沉積以及有性生殖;2）Δznf1產孢能力顯著增加，

5、說明ZNF1可能負調控分生孢子的形成;3）Δznf1突變體對大麥和水稻的致病性完全喪失，即使在劃傷或針刺的大麥和水稻葉片表面都不能產生病斑;4）Δznf1突變體芽管頂端可以分化形成膨大結構，但是不能形成正常的附著胞，也不能穿透寄主表皮;5）外源cAMP或IBMX能夠誘導Δznf1突變體分生孢子在親水或疏水表面上產生囊泡狀的膨大結構。但外源添加cAMP或IBMX不能完全恢復Δznf1附著胞形成缺陷;6）qRT-PCR以及GFP熒光檢測表明

6、，稻瘟病菌營養(yǎng)生長和產孢階段ZNF1表達水平較低，而附著胞發(fā)育與成熟階段ZNF1表達水平顯著升高。在突變體Δpmk1中，ZNF1表達水平受到抑制。表明ZNF1在附著胞發(fā)育階段表達水平受Pmk1 MAPK信號途徑調控;7）Nile Red和I2/KI染色表明，ZNF1參與附著胞形成過程中脂滴和糖原的移動以及降解;8）H1-RFP標記顯示Δznf1附著胞形成過程中，芽管尖端能進行多次有絲分裂，但細胞核不被降解，細胞自噬性降解過程受阻;9）結

7、構域缺失和點突變實驗顯示3個C2H2鋅指結構以及核定位信號序列(NLS)對Znf1蛋白功能起重要作用。
　　3.CKS1編碼細胞周期蛋白依賴性激酶復合物的亞基(Cyclin-dependent kinasesubunit)，參與稻瘟病菌營養(yǎng)生長、產孢、致病性等重要過程
　　在先前的研究中，本實驗室鑒定了一個新的稻瘟病菌轉錄調控因子Som1。研究表明Som1作用于稻瘟病菌cAMP-PKA信號途徑下游，在稻瘟病菌形態(tài)分化和致病性

8、中起關鍵作用。本研究根據(jù)Δsom1的SAGE(serial analysis of geneexpression)表達譜測序數(shù)據(jù)并結合生物信息學分析，選取了8個可能與Som1相關的基因進行了敲除，其中Δcks1表型明顯與野生型菌株不同。本實驗進一步對CKS1的生物學功能進行了分析，結果如下:1）酵母雙雜交實驗證明稻瘟病菌中Cks1與Som1之間存在互作;2）Δcks1突變體營養(yǎng)生長緩慢，菌落發(fā)白，氣生菌絲蓬松，不能產生分生孢子;3）qR

9、T-PCR分析顯示，色素合成基因ALB1、RSY1和BUF1，以及產孢相關基因COS1、CON7、ACR1、HTF1(HOX2)在Δcks1中顯著下調;4）Δcks1能在菌絲尖端產生附著胞結構，但附著胞功能喪失，不能穿透寄主表皮，也不能在寄主組織內進行侵染生長;5）Δcks1突變體幾乎完全喪失對大麥和水稻的致病性;6）Δcks1菌落疏水性下降，菌落呈現(xiàn)自溶現(xiàn)象;7）Δcks1突變體對細胞壁壓力脅迫抗性增加，幾丁質合成酶編碼基因的轉錄水平

10、在Δcks1中明顯上調，表明CKS1參與維持稻瘟病菌細胞壁完整性;8）小麥赤霉病菌的FgCKS1能恢復稻瘟病菌Δc ks1的表型缺陷，表明在絲狀病原真菌中Cks1結構和功能都非常保守;9）Cks1-GFP融合蛋白亞細胞定位分析表明，Cks1在營養(yǎng)生長階段主要定位于細胞質中，而分生孢子形成階段，細胞質和細胞核中都有明顯的分布;10)結構域缺失實驗表明Cks1蛋白中Ubiquitin-binding domain，Cdc28-binding