ICAM-1和CX3CL1對內(nèi)皮細胞骨架的影響及其機制的探討.pdf

1、目的：觀察ICAM-1和 CX3CL1對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）骨架的影響，探討其可能的機制。
　　方法：（1）觀察ICAM-1和CX3CL1對HUVECs的骨架蛋白F-actin的影響：HUVECs饑餓處理12 h；○110μM Fg刺激HUVECs30 min后，1 nM ICAM-1分別刺激HUVECs0、30、60、120、180 min；○210 nM CX3CL1分別刺激HUVECs0、30、60、120、18

2、0 min；4％多聚甲醛固定細胞后，用Alexafluor?488 phalloidin對細胞骨架蛋白F-actin進行熒光染色，熒光顯微鏡下觀察細胞F-actin形態(tài)和分布情況。
　　(2)檢測ICAM-1和CX3CL1對HUVECs的MAPK信號通路的影響：HUVECs饑餓處理12 h；○110μM Fg刺激HUVECs30 min后1 nM ICAM-1分別刺激HUVECs0、5、15、30、60 min；○210 nM C

3、X3CL1分別刺激HUVECs0、1、5、15、30 min；○35μg/mL抗ICAM-1+10μM Fg刺激細胞30 min后，1 nM ICAM-1刺激細胞5 min、15 min和15 min、30 min；○45μg/mL抗CX3CR1抗體刺激內(nèi)皮細胞30 min后,10 nM CX3CL1刺激細胞1min和5 min；提取細胞總蛋白，Western blot檢測磷酸化p38、ERK1/2和JNK1/2和總p38、ERK1/2

4、和JNK1/2的表達水平。
　　(3)探討ICAM-1和CX3CL1介導(dǎo)的HUVECs骨架改變的機制：HUVECs饑餓處理12 h；○130μM的（SB203580p38的特異性抑制劑）、PD98059（ERK1/2的特異性抑制劑）和SP600125（JNK1/2的特異性拮抗劑）分別刺激內(nèi)皮細胞30 min后，10μM Fg刺激HUVECs30 min，隨后1 nM ICAM-1在刺激HUVECs180 min；○230μM SB

5、203580、PD98059和SP600125分別刺激HUVECs1 h后，10 nM CX3CL1刺激HUVECs120 min；固定細胞后，對細胞進行熒光染色，熒光顯微鏡下觀察細胞F-actin形態(tài)和分布情況。
　　結(jié)果：(1)空白對照的HUVECs的細胞周邊的F-actin形成光滑而連續(xù)的外周致密帶。1 nM ICAM-1刺激HUVECs30 min后，細胞沒有明顯變化；60 min后胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)少量應(yīng)力纖維，細胞膜外周的F-

6、actin成鋸齒狀，致密帶被破壞；120 min后，細胞周邊的F-actin基本消失，細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量纖細的應(yīng)力纖維；180 mim后細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)密集的貫穿整個細胞的應(yīng)力纖維，細胞變形。10 nM CX3CL1刺激HUVECs30 min后胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)少量應(yīng)力纖維，細胞外周的F-actin成鋸齒狀，致密帶被破壞；60 min后，細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量纖細的應(yīng)力纖維，而細胞周邊的F-actin基本消失；120 min后細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)密集的貫穿整個細

7、胞的應(yīng)力纖維，細胞變形；180 min后在胞質(zhì)內(nèi)的應(yīng)力纖維變短而稀疏。
　　(2)1nM ICAM-1刺激HUVECs5 min后p38、ERK1/2和JNK1/2磷酸化水平高于空白對照的細胞，15 min后磷酸化ERK1/2和JNK1/2的表達水平達峰值，而磷酸化p38的的表達水平在30 min后達峰值；10 nM CX3CL1刺激HUVECs1 min后p38、ERK1/2和JNK1/2磷酸化水平高于空白對照的細胞，三者的磷酸

8、化水平均在5 min后達峰值；5μg/mL抗1nM ICAM-1抗體抑制ICAM-1介導(dǎo)的p38、ERK1/2和JNK1/2磷酸化水平的上調(diào)；5μg/mL抗CX3CR1抗體抑制10 nM CX3CL1介導(dǎo)的的p38、ERK1/2和JNK1/2磷酸化水平的上調(diào)。
　　(3)30μM SB203580提前干預(yù)后，1nM ICAM-1刺激內(nèi)皮細胞后引起的F-actin的重排及應(yīng)力纖維的形成被抑制，30μM SB203580和PD9805