骨髓基質細胞側腦室移植對帕金森病模型大鼠行為和認知功能的影響.pdf

1、目的：帕金森?。╬arkinson’s disease，PD）是一種多發(fā)于中老年人的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理特點是中腦黑質多巴胺能神經(jīng)元變性壞死和紋狀體區(qū)多巴胺（dopamine，DA）水平減少。臨床上以進行性加重的運動遲緩、肌強直、靜止性震顫、姿勢步態(tài)異常等為特征。近年來研究表明帕金森病患者不僅有運動障礙，而且有逐漸進展的認知功能下降，并伴有一定的焦慮、抑郁情緒，嚴重者出現(xiàn)癡呆，稱為帕金森病癡呆（Parkinson’s dis

2、ease with dementia，PDD），嚴重影響了患者的生活質量。傳統(tǒng)的藥物治療和外科手術方法只能部分改善癥狀，長期療效并不樂觀，而細胞移植已成為目前研究的熱點。骨髓基質細胞（Bone Marrow Stromal Cells，BMSCs）取材方便，來源充足，可在短時間內大量擴增，并可進行自體移植，避免了異體間移植可能引起的免疫排斥和倫理道德上的爭議，這些優(yōu)點均使其成為理想的種子細胞。腦內注射6-羥基多巴胺（6-hydroxyd

3、opamine，6-OHDA）制作PD模型常用于研究PD的運動功能障礙及療效的觀察，近年來人們開始關注其認知功能障礙。而目前研究多將BMSCs立體定向移植到6-OHDA所致PD模型大鼠的紋狀體，可有效改善大鼠的旋轉行為，但尚未見有側腦室移植BMSCs治療PD模型的報道。本研究將6-OHDA注射于單側黑質致密部和腹側被蓋區(qū)制成PD模型，對PD模型運動和認知兩方面的改變進行觀察，并將同種異體來源的BMSCs在體外擴增培養(yǎng)后，立體定向移植到6

4、-OHDA所致PD大鼠的側腦室，觀察側腦室移植BMSCs對PD大鼠的運動和認知功能的影響。
　　 方法：
　　 ①動物：封閉群清潔級健康雌性Sprague Dawley（SD）大鼠由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。
　　 ②實驗方法：正常成年SD大鼠60只，腹腔注射阿樸嗎啡（apomorphine，APO）淘汰有旋轉行為的大鼠1只，Morris水迷宮淘汰有記憶障礙的大鼠2只

5、后，隨機取8只大鼠歸入正常組，其余大鼠用水合氯醛麻醉，利用立體定向儀單側黑質致密部和腹側被蓋區(qū)注射6-OHDA制作右側PD模型，手術后3周腹腔注射APO誘導其旋轉，旋轉次數(shù)大于7r/min的視作制模成功。將成功的34只PD模型大鼠隨機分為BMSC組16只、PBS組10只、模型組8只。選取BMSC組大鼠右側側腦室（坐標：前囟后1.5mm，矢狀縫右側1.0mm，硬膜下3.8mm）為注射點，注入經(jīng)Brd-U標記的BMSCs懸液10μl（約1.

6、0×106個細胞），PBS組同法于大鼠右側側腦室注入等量磷酸緩沖液（PBS），模型組和正常組不作任何處理。
　　 ③實驗評估：細胞移植后連續(xù)8周觀察APO誘導的PD大鼠旋轉行為的變化；制模前、制模成功后（即細胞移植前）、細胞移植后第4周、細胞移植后第8周分別進行Morris水迷宮測試，對各組大鼠的認知功能進行評價。側腦室移植后第1、3、7天及移植后8周各取兩只BMSC組大鼠，對腦側腦室區(qū)連續(xù)冠狀石蠟切片進行免疫組織化學染色，檢測

7、BrdU陽性細胞。細胞移植后8周，取各組大鼠腦黑質區(qū)連續(xù)冠狀石蠟切片免疫組化染色檢測酪氨酸羥化酶（tvrosinehvdroxvlase.TH）陽性細胞。
　　 結果：
　　 ①PD大鼠運動功能改變：與移植前比較，細胞移植后第1-8周腹腔注射APO誘導BMSC組PD大鼠的旋轉次數(shù)明顯減少，轉數(shù)從移植前的（13.5±4.9）r/min降到移植后第8周的（8.7±3.8）r/min，移植前后的數(shù)據(jù)相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<

8、0.05）；PBS組和模型組移植前旋轉次數(shù)分別為（15.1±3.9）r/min、（17.8±3.4）r/min，移植后第8周分別為（18.1±4.0）r/min、（19.7±4.8）r/min，移植前后差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與PBS組和模型組比較，APO誘導BMSC組PD大鼠的旋轉次數(shù)從第1周開始就有明顯減少（P<0.05），從第3周即有顯著減少（P<0.01）；PBS組和模型組各時間點比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

9、
　　 ②認知功能改變：制作模型前，BMSC組、PBS組、模型組、正常組四組大鼠的尋臺潛伏期、在原平臺所在象限所占時間百分比、路程百分比、穿越平臺次數(shù)均無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。制模成功后即細胞移植前，與正常組相比，BMSC組、PBS組、模型組三組大鼠的尋臺潛伏期均顯著延長（P<0.05），在原平臺所在象限所占時間百分比、路程百分比、穿越平臺次數(shù)均顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；而BM.SC組、PBS組、模型組三

10、組之間無差異（P>0.05）。細胞移植后第4周和細胞移植后第8周，BMSC組的尋臺潛伏期與PBS組、模型組相比顯著縮短（P<0.05），在原平臺所在象限所占時間百分比、路程百分比、穿越平臺次數(shù)均顯著增加（P<0.05），與正常組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；PBS組、模型組與正常組相比，尋臺潛伏期明顯延長（P<0.05），在原平臺所在象限所占時間百分比、路程百分比、穿越平臺次數(shù)均顯著減少（P<0.05）；而模型組與PBS組相比

11、，上述指標均無顯著性差異（P>0.05）。
　　 ③免疫組織化學染色結果：BMSC組在側腦室移植BMSC后第1天可見側腦室壁與脈絡叢存在大量BrdU陽性細胞，移植后第3天可見細胞沿胼胝體有少量遷移，移植后第7天依然可見脈絡叢中散在的陽性BrdU細胞，并且在胼胝體、腦室外側的周圍腦實質均可見散在的陽性細胞，而在移植后8周時未見有明顯陽性細胞。移植后第8周BMSC組、PBS組、模型組的6-OHDA注射側黑質區(qū)TH陽性神經(jīng)元和神經(jīng)纖維

12、表達基本缺失。
　　 結論：
　　 ①BMSC組移植后APO誘導的PD大鼠旋轉行為從第1周即有明顯改善，并且可以持續(xù)至少8周。
　　 ②單側黑質致密部和腹側被蓋區(qū)注射6-OHDA制成的PD模型大鼠有明顯的認知障礙，主要表現(xiàn)在空間參考和空間工作記憶的下降。
　　 ③側腦室移植BMSCs可明顯改善6-OHDA所致PD大鼠的認知功能障礙。
　　 ④BMSCs側腦室移植可存活并遷移至胼胝體和腦室外周的腦組