HCV多CTL表位樹突狀細胞疫苗的構(gòu)建及體外刺激T細胞反應(yīng).pdf

1、丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus,HCV）是引起慢性肝臟疾病的主要原因之一，全世界約有1.7億HCV感染者，丙肝感染已成為全球性的、嚴重的公共衛(wèi)生問題之一。HCV感染后，約50％～85％發(fā)展為慢性肝病，甚至肝纖維化、肝硬化、肝細胞癌。目前，聚乙二醇干擾素-α和利巴韋林聯(lián)合應(yīng)用是丙型肝炎治療的標(biāo)準(zhǔn)方案，其持續(xù)應(yīng)答率只有50％，且副作用大，費用昂貴，停止治療后仍有很高的復(fù)發(fā)率。目前還沒有有效的抗HCV疫苗，所以研制預(yù)防性和治療性

2、抗HCV疫苗很重要。
　　以抗原表位預(yù)測和人工合成抗原表位基因為基礎(chǔ)的多表位DNA疫苗是新型疫苗研究熱點。表位又稱抗原決定簇，是指免疫細胞能識別的抗原分子上的一個特定部位，可以和病毒的受體結(jié)合。重組多表位疫苗是指同時攜帶多個目標(biāo)抗原相關(guān)表位以及輔助性表位的疫苗，它能有效地應(yīng)付病原微生物的變異，克服主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子的遺傳限制，為特異性免疫治療和基因治療奠定了基礎(chǔ)。要獲得具有較強免疫原性的HCV多肽，廣泛地激發(fā)機體的

3、CD8+T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，必須具有HCV不同區(qū)段的多個表位。我們利用生物信息學(xué)方法，用計算機預(yù)測出12條多肽，分別用每條肽體外刺激外周血單個核細胞，觀察其增殖情況，ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中IFN-γ水平的變化。結(jié)果顯示預(yù)測的HCVCTL表位NS4B(1793-1801)和P7（774-782）在體外能夠刺激T細胞反應(yīng)。
　　樹突狀細胞是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗原提呈細胞，是啟動、調(diào)控并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)，其最大特點在于能

4、夠激活初始型T細胞，啟動獲得性免疫，故是機體免疫應(yīng)答的始動者，在免疫反應(yīng)中起到舉足輕重的作用。目前，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)DC制成的DC疫苗已成為研究的熱點。利用腺病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移，以其高效和良好的靶向性成為基因治療中常用的方法。
　　我們在此研究基礎(chǔ)上構(gòu)建含能表達這兩個HCV多CTL表位的DC疫苗，體外觀察其促進T細胞的反應(yīng)和細胞毒殺傷效應(yīng)，為抗HCV的DC疫苗研制打下基礎(chǔ)。
　　1．DC的體外培養(yǎng)和鑒定
　　全血來自于健康供

5、者，經(jīng)Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC），按CD14MicroBeadshumanmonocytekit(MACS)操作說明，分離收集CD14+單核細胞。用無血清培養(yǎng)液X-VIVO15調(diào)整CD14+單核細胞密度為1×106cells/mL接種于24孔板，并加入GM-CSF(1000U/ml)和IL-4(1000U/ml)5％C02，37℃孵育培養(yǎng)5天，隔日半量換液，，第5天起加入成熟誘導(dǎo)因子TNF

6、-α（10ng/mL）、IL-1β（10ng/mL）、IL-6（10ng/mL）、PGE2（1μg/mL）培養(yǎng)2天，即可誘導(dǎo)出成熟的樹突狀細胞。顯微鏡和流式細胞儀觀察和鑒定DC成熟狀態(tài)。
　　2．負載HCV多表位的腺病毒刺激DC
　　重組腺病毒表達質(zhì)粒AD1（多HCV表位）、AD2(陽性對照)和AD3（陰性對照）以50至1000感染復(fù)數(shù)（MOI）感染DC，于感染后48h熒光鏡下觀察細胞GFP的表達，應(yīng)用流式細胞術(shù)（FCM）測

7、定腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染DC的效率。PCR和Westernblot檢測DC細胞內(nèi)重組HCV多表位抗原基因序列的存在和表達。
　　3．DC體外刺激T細胞
　　收集感染重組腺病毒和未感染重組腺病毒的DC作為刺激細胞，取CD14-PBMC為效應(yīng)細胞，進行混合淋巴細胞培養(yǎng)。ELISA檢測DC上清IL-12p70和混合淋巴細胞培養(yǎng)上清IFN-γ。用LDH釋放法檢測CTL活性。
　　結(jié)果：
　　1．DC呈半懸浮生長，胞體不規(guī)則增

8、大，胞膜向外伸出呈樹枝樣突起。用流式細胞儀檢測不成熟DC、成熟DC和腺病毒感染DC的表面標(biāo)志CD83、CD86、CD80和HLA-DR，結(jié)果顯示成熟DC和腺病毒感染DC比不成熟DC的表面標(biāo)志表達明顯升高。
　　2．重組腺病毒有效感染DC，熒光鏡下細胞有GFP的表達。用特異性引物對重組腺病毒感染24h后DC的總RNA進行PCR，結(jié)果顯示在150bp處有特異性擴增條帶，其大小與目的基因大小相符。用鼠抗FLAG抗體為一抗，HRP標(biāo)記的羊

9、抗鼠IgG為二抗，對重組腺病毒感染48h后DC的總蛋白進行Westernblot分析，結(jié)果可見大小約為10KD的蛋白，這與預(yù)計的序列1-FLAG和序列2-FLAG融合蛋白大小一致，表明DC成功表達出序列1和序列2蛋白。
　　3．DC能刺激T細胞增殖，腺病毒感染DC分泌IL-12p70增多，其刺激T細胞分泌IFN-γ增多。重組多CTL表位腺病毒感染的DC可誘導(dǎo)特異性的細胞免疫應(yīng)答。
　　綜上所述，重組多CTL表位腺病毒在體外能