IGFBP3及相關(guān)基因在口腔磷癌中的作用研究.pdf

1、目的：課題組前期研究建立了人口腔黏膜上皮細胞體外癌變模型，包括永生化的HIOEC細胞和成瘤的HB細胞，為研究口腔鱗癌癌變發(fā)生發(fā)展過程的分子機制提供了理想的研究對象。采用寡核苷酸芯片方法檢測口腔癌變模型各個階段細胞的基因表達譜，發(fā)現(xiàn)大量差異表達基因。但是基因芯片的結(jié)果存在一定的假陽性或假陰性，而且體外建立的細胞模型與體內(nèi)腫瘤形成過程存在一定的差別，因此有必要在細胞株和臨床組織標(biāo)本中驗證差異基因的表達，為后續(xù)基因功能研究和應(yīng)用研究打下基礎(chǔ)。

2、
　　 方法：1、應(yīng)用Realtime PCR和Western blotting方法在口腔黏膜上皮細胞癌變模型和另5株口腔鱗癌細胞系中驗證IGFBP3基因的mRNA和蛋白的表達。
　　 2、應(yīng)用Realtime PCR和免疫組化方法在30例口腔鱗癌組織標(biāo)本和癌旁組織中驗證IGFBP3基因的mRNA和蛋白的表達，初步探討基因的表達與煙酒暴露、腫瘤部位、大小、臨床分期、病理分級等臨床病理的關(guān)系。
　　 3、分別應(yīng)用小

3、RNA干擾技術(shù)和基因克隆DNA重組技術(shù)研究IGFBP3基因?qū)谇击[癌細胞增殖、細胞凋亡、克隆形成等生物學(xué)行為的影響。應(yīng)用針對IGFBP3的小RNA構(gòu)建RNAi重組慢病毒載體，感染鱗癌細胞并接種在裸鼠皮下，觀察干擾IGFBP3表達對口腔鱗癌細胞成瘤能力的影響。
　　 4、應(yīng)用Realtime PCR和Western blotting方法在口腔鱗癌細胞和臨床組織樣本里檢測PRKDC、TGFBR2、SMAD2、SMAD3、△Np63α

4、和S100A6等基因的表達情況，分析其表達與IGFBP3基因表達的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：1、IGFBP3基因的mRNA和蛋白表達水平在成瘤的HB細胞、CAL27和OSC口腔鱗癌細胞株中均高于永生化的HIOEC細胞。IGFBP3基因的mRNA和蛋白水平在口腔鱗癌組織標(biāo)本中高表達，其mRNA表達與腫瘤患者的吸煙、飲酒、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、病理分級等臨床指標(biāo)間未見有明顯相關(guān)性，其蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期具有顯著相關(guān)性

5、。
　　 2、構(gòu)建IGFBP3基因小RNA干擾質(zhì)粒并建立干擾穩(wěn)定株，IGFBP3基因小RNA干擾能抑制HB、Tca8113和CAL27細胞的增殖，細胞凋亡能力增加及克隆形成能力降低。包裝干擾IGFBP3表達的慢病毒載體并篩選出干擾穩(wěn)定株，CAL27細胞裸鼠體內(nèi)成瘤能力降低。構(gòu)建IGFBP3基因過表達質(zhì)粒，IGFBP3基因過表達對HB、HBT和Tca8113細胞增殖速度加快，克隆形成能力未見明顯增強。
　　 3、PRKDC

6、基因的mRNA在成瘤的HB細胞中高表達，在口腔鱗癌臨床樣本中高表達；PRKDC表達和IGFBP3兩者表達之間具有顯著相關(guān)性。
　　 4、TGFβ超家族成員SMAD2基因的mRNA在HB細胞和Tca8113細胞中高表達；在口腔鱗癌臨床樣本中高表達，且與吸煙及腫瘤大小相關(guān)；SMAD2表達與IGFBP3表達兩者之間無顯著相關(guān)性。
　　 5、p63家族成員△Np63α基因的mRNA和蛋白在口腔鱗癌細胞CAL27和OSC中高表達；

7、△Np63α基因的mRNA在口腔鱗癌臨床樣本中高表達；△Np63α表達與IGFBP3表達兩者之間無顯著相關(guān)性。
　　 6、S100A6基因的mRNA和蛋白在成瘤的HB細胞中表達低于永生化的HIOEC細胞；S100A6基因的mRNA在口腔鱗癌組織標(biāo)本中低表達；S100A6表達與IGFBP3表達兩者之間無顯著相關(guān)性。
　　 結(jié)論：1、IGFBP3在口腔鱗癌癌變過程中及臨床樣本中表達升高，驗證了基因芯片的結(jié)果。
　　

8、2、小RNA干擾IGFBP3基因能抑制口腔鱗癌細胞的增殖、克隆形成和裸鼠皮下成瘤能力，促進鱗癌細胞凋亡，可以考慮作為腫瘤基因治療靶點的候選基因。
　　 3、在口腔鱗癌臨床樣本中，IGFBP3 mRNA表達和PRKDC mRNA表達兩者之間有顯著正相關(guān)性，可能是PRKDC基因參與了IGFBP3基因的調(diào)控從而使IGFBP3基因在口腔鱗癌中高表達。
　　 4、在口腔鱗癌臨床樣本中，IGFBP3 mRNA表達和TGFβ超家族成員