IGFBP3及相關(guān)基因在口腔磷癌中的作用研究.pdf

1、目的：課題組前期研究建立了人口腔黏膜上皮細(xì)胞體外癌變模型，包括永生化的HIOEC細(xì)胞和成瘤的HB細(xì)胞，為研究口腔鱗癌癌變發(fā)生發(fā)展過程的分子機(jī)制提供了理想的研究對象。采用寡核苷酸芯片方法檢測口腔癌變模型各個階段細(xì)胞的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)大量差異表達(dá)基因。但是基因芯片的結(jié)果存在一定的假陽性或假陰性，而且體外建立的細(xì)胞模型與體內(nèi)腫瘤形成過程存在一定的差別，因此有必要在細(xì)胞株和臨床組織標(biāo)本中驗(yàn)證差異基因的表達(dá)，為后續(xù)基因功能研究和應(yīng)用研究打下基礎(chǔ)。

2、
　　 方法：1、應(yīng)用Realtime PCR和Western blotting方法在口腔黏膜上皮細(xì)胞癌變模型和另5株口腔鱗癌細(xì)胞系中驗(yàn)證IGFBP3基因的mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 2、應(yīng)用Realtime PCR和免疫組化方法在30例口腔鱗癌組織標(biāo)本和癌旁組織中驗(yàn)證IGFBP3基因的mRNA和蛋白的表達(dá)，初步探討基因的表達(dá)與煙酒暴露、腫瘤部位、大小、臨床分期、病理分級等臨床病理的關(guān)系。
　　 3、分別應(yīng)用小

3、RNA干擾技術(shù)和基因克隆DNA重組技術(shù)研究IGFBP3基因?qū)谇击[癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、克隆形成等生物學(xué)行為的影響。應(yīng)用針對IGFBP3的小RNA構(gòu)建RNAi重組慢病毒載體，感染鱗癌細(xì)胞并接種在裸鼠皮下，觀察干擾IGFBP3表達(dá)對口腔鱗癌細(xì)胞成瘤能力的影響。
　　 4、應(yīng)用Realtime PCR和Western blotting方法在口腔鱗癌細(xì)胞和臨床組織樣本里檢測PRKDC、TGFBR2、SMAD2、SMAD3、△Np63α

4、和S100A6等基因的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與IGFBP3基因表達(dá)的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：1、IGFBP3基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平在成瘤的HB細(xì)胞、CAL27和OSC口腔鱗癌細(xì)胞株中均高于永生化的HIOEC細(xì)胞。IGFBP3基因的mRNA和蛋白水平在口腔鱗癌組織標(biāo)本中高表達(dá)，其mRNA表達(dá)與腫瘤患者的吸煙、飲酒、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、病理分級等臨床指標(biāo)間未見有明顯相關(guān)性，其蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期具有顯著相關(guān)性

5、。
　　 2、構(gòu)建IGFBP3基因小RNA干擾質(zhì)粒并建立干擾穩(wěn)定株，IGFBP3基因小RNA干擾能抑制HB、Tca8113和CAL27細(xì)胞的增殖，細(xì)胞凋亡能力增加及克隆形成能力降低。包裝干擾IGFBP3表達(dá)的慢病毒載體并篩選出干擾穩(wěn)定株，CAL27細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成瘤能力降低。構(gòu)建IGFBP3基因過表達(dá)質(zhì)粒，IGFBP3基因過表達(dá)對HB、HBT和Tca8113細(xì)胞增殖速度加快，克隆形成能力未見明顯增強(qiáng)。
　　 3、PRKDC

6、基因的mRNA在成瘤的HB細(xì)胞中高表達(dá)，在口腔鱗癌臨床樣本中高表達(dá)；PRKDC表達(dá)和IGFBP3兩者表達(dá)之間具有顯著相關(guān)性。
　　 4、TGFβ超家族成員SMAD2基因的mRNA在HB細(xì)胞和Tca8113細(xì)胞中高表達(dá)；在口腔鱗癌臨床樣本中高表達(dá)，且與吸煙及腫瘤大小相關(guān)；SMAD2表達(dá)與IGFBP3表達(dá)兩者之間無顯著相關(guān)性。
　　 5、p63家族成員△Np63α基因的mRNA和蛋白在口腔鱗癌細(xì)胞CAL27和OSC中高表達(dá)；

7、△Np63α基因的mRNA在口腔鱗癌臨床樣本中高表達(dá)；△Np63α表達(dá)與IGFBP3表達(dá)兩者之間無顯著相關(guān)性。
　　 6、S100A6基因的mRNA和蛋白在成瘤的HB細(xì)胞中表達(dá)低于永生化的HIOEC細(xì)胞；S100A6基因的mRNA在口腔鱗癌組織標(biāo)本中低表達(dá)；S100A6表達(dá)與IGFBP3表達(dá)兩者之間無顯著相關(guān)性。
　　 結(jié)論：1、IGFBP3在口腔鱗癌癌變過程中及臨床樣本中表達(dá)升高，驗(yàn)證了基因芯片的結(jié)果。
　　

8、2、小RNA干擾IGFBP3基因能抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、克隆形成和裸鼠皮下成瘤能力，促進(jìn)鱗癌細(xì)胞凋亡，可以考慮作為腫瘤基因治療靶點(diǎn)的候選基因。
　　 3、在口腔鱗癌臨床樣本中，IGFBP3 mRNA表達(dá)和PRKDC mRNA表達(dá)兩者之間有顯著正相關(guān)性，可能是PRKDC基因參與了IGFBP3基因的調(diào)控從而使IGFBP3基因在口腔鱗癌中高表達(dá)。
　　 4、在口腔鱗癌臨床樣本中，IGFBP3 mRNA表達(dá)和TGFβ超家族成員