TGM3和MAL基因在口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展中作用.pdf

1、第一部分
　　目的：為篩選和鑒定參與口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的生物標(biāo)志物，本課題組前期采用基因表達(dá)譜芯片，篩選發(fā)現(xiàn)Transglutaminase3(TGM3)基因在口腔鱗癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)。本研究旨在驗(yàn)證TGM3在口腔鱗癌中的表達(dá)水平；探討其表達(dá)下調(diào)的機(jī)制；分析TGM3對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖、克隆形成、凋亡和體內(nèi)成瘤等生物學(xué)特點(diǎn)的影響；分析TGM3表達(dá)水平與口腔鱗癌臨床病理、預(yù)后的關(guān)系。
　　方法：采用半定量RT-PCR、實(shí)時(shí)

2、定量RT-PCR和蛋白印跡技術(shù)，分別在9例口腔鱗癌細(xì)胞系和53對(duì)口腔鱗癌組織樣本中檢測(cè)TGM3的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平；使用DNA去甲基化藥物5-Aza-dC和組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA，處理口腔鱗癌細(xì)胞系后檢測(cè)TGM3表達(dá)水平變化，通過亞硫酸氫鹽測(cè)序分析口腔鱗癌細(xì)胞系以及口腔鱗癌組織樣本中TGM3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平；在TGM3低表達(dá)的口腔鱗癌細(xì)胞中，過表達(dá)外源性TGM3后，分析其對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖、克隆形成、凋亡和裸鼠皮下成瘤能力的影響

3、；采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)101例口腔鱗癌組織樣本中TGM3蛋白表達(dá)水平，分析其表達(dá)與口腔鱗癌臨床病理、預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：TGM3的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平在口腔鱗癌細(xì)胞系及組織樣本中表達(dá)顯著下調(diào)；DNA去甲基化藥物5-Aza-dC可以劑量依賴性地上調(diào)TGM3的表達(dá)，亞硫酸氫鹽測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，口腔鱗癌細(xì)胞和組織樣本中TGM3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平顯著高于正?？谇火つぜ?xì)胞和配對(duì)的癌周正常組織；表達(dá)外源性TGM3可以顯著抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增

4、殖和克隆形成，能誘導(dǎo)凋亡并抑制口腔鱗癌細(xì)胞的裸鼠皮下成瘤能力；TGM3蛋白在口腔鱗癌組織中的表達(dá)與病理分化呈正相關(guān)(P=0.0037)；TGM3高表達(dá)的口腔鱗癌患者生存率顯著優(yōu)于TGM3低表達(dá)的口腔鱗癌患者(P=0.0002)；多因素Cox回歸分析顯示，TGM3的表達(dá)水平可以作為判斷口腔鱗癌患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)(HR,0.286;95％CI,0.103-0.796;P=0.016)。
　　結(jié)論:DNA甲基化導(dǎo)致了TGM3基因在口腔鱗

5、癌中的表達(dá)下調(diào)；TGM3作為一個(gè)抑癌基因參與了口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展；TGM3可以作為判斷口腔鱗癌患者預(yù)后的候選生物標(biāo)志物。
　　第二部分
　　目的：本課題組前期采用基因表達(dá)譜芯片篩選發(fā)現(xiàn)，Myelin and lymphocyte associated protein(MAL)基因在口腔鱗癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)，通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MAL基因作為抑癌基因影響口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、克隆形成、凋亡、侵襲和裸鼠皮下成瘤能力。本研究旨

6、在通過構(gòu)建MAL基因敲除鼠，在整體動(dòng)物水平進(jìn)一步研究MAL基因在口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的功能和作用。
　　方法：通過基因打靶、同源重組技術(shù)構(gòu)建MAL基因敲除鼠；采用PCR技術(shù)在DNA水平鑒定 MAL小鼠的基因型；通過胚胎發(fā)育、個(gè)體發(fā)育表型分析、血液生化指標(biāo)分析、各組織器官組織病理學(xué)分析比較MAL純合子、雜合子和野生型小鼠可能存在的差異；采用不同劑量的4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide,4-NQ

7、O)誘導(dǎo)MAL純合子、雜合子和野生型小鼠口腔黏膜成瘤，分析比較MAL純合子、雜合子和野生型小鼠在口腔黏膜病變發(fā)生率、發(fā)生時(shí)間、病變數(shù)量、病變進(jìn)展速度和病變組織病理特征的差異。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建了MAL基因敲除鼠；完成了MAL基因敲除鼠的保種、繁殖、傳代；鑒定了新繁殖出的233只MAL小鼠的基因型；MAL純合子、雜合子和野生型小鼠在胚胎發(fā)育、個(gè)體發(fā)育、血常規(guī)、血液生化、各主要器官組織學(xué)結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)差異；暴露較小劑量4NQO（40μg

8、/ml）誘導(dǎo)下，MAL純合子小鼠發(fā)生口腔或食道黏膜的良性腫瘤或早期癌，而MAL雜合子、野生型小鼠經(jīng)相同劑量和時(shí)間4NQO誘導(dǎo)，僅發(fā)生口腔黏膜上皮異常增生；暴露較大劑量4NQO（80μg/ml）誘導(dǎo)下，發(fā)現(xiàn)MAL純合子小鼠發(fā)生口腔黏膜病變時(shí)間較雜合子、野生型小鼠發(fā)生口腔黏膜病變時(shí)間顯著提前，MAL純合子小鼠較雜合子、野生型小鼠口腔黏膜病變進(jìn)展速度顯著增快，MAL純合子小鼠發(fā)生口腔黏膜病變數(shù)量較雜合子、野生型小鼠發(fā)生口腔黏膜病變數(shù)量顯著增多