腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的HGFK1對人前列腺癌裸鼠骨移植瘤模型的治療作用研究.pdf

1、背景：
　　 前列腺癌是男性常見惡性腫瘤，而且極易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。此前有研究提示肝細(xì)胞生長因子Kringle 1結(jié)構(gòu)域(HGFK1)基因能夠明顯抑制腫瘤血管生成，同時能夠阻斷表皮生長因子（EGF）對于表皮生長因子受體（EGFR）的激活作用。
　　 目的：
　　 （1）體內(nèi)實驗觀察肝細(xì)胞生長因子Kringle 1結(jié)構(gòu)域(HGFK1)基因?qū)θ饲傲邢侔┞闶竺劰枪撬枨粌?nèi)移植瘤生長及轉(zhuǎn)移的治療作用，并初步探討其相關(guān)機(jī)制。

2、>　　 （2）體外實驗觀察肝細(xì)胞生長因子Kringle 1結(jié)構(gòu)域(HGFK1)基因?qū)θ饲傲邢侔┘?xì)胞株P(guān)C3細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的治療情況，并初步探討其相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：
　　 一、體內(nèi)實驗方法
　　 （1）構(gòu)建攜帶有HGFK1基因和增強(qiáng)型綠色螢光蛋白基因（EGFP）的腺相關(guān)病毒載體(rAAV- HGFK1，rAAV-EGFP)。
　　 （2）通過向裸鼠脛骨骨髓腔內(nèi)注射人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3細(xì)胞懸液建立

3、人前列腺癌裸鼠骨移植瘤模型。
　　 （3）通過向瘤內(nèi)和尾靜脈內(nèi)注射PBS、rAAV-EGFP或rAAV-HGFK1分別治療荷瘤裸鼠。
　　 （4）觀察三個治療組的裸鼠人前列癌骨移植瘤模型的腫瘤生長情況、生存時間、腫瘤內(nèi)血管密度及轉(zhuǎn)移情況。
　　 （5）免疫組化方法觀察三組裸鼠腫瘤組織增殖及轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)的變化。
　　 二、體外實驗方法
　　 （1）腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染情況觀察：rAAV-EGFP轉(zhuǎn)染PC3

4、細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下觀察PC3細(xì)胞內(nèi)綠色螢光蛋白的表達(dá)情況。計算轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率。RT-PCR法測定rAAV-HGFK1轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞后HGFK1的表達(dá)情況。
　　 （2）細(xì)胞增殖情況觀察： CCK8法（WST-8法）觀察PBS、rAAV-EGFP及rAAV-HGFK1治療后，前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3細(xì)胞生長曲線的變化情況。
　　 （3）細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況觀察：傷口愈合實驗觀察PBS、rAAV-EGFP及rAAV-HGFK1治療后，

5、前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3細(xì)胞遷移能力的變化情況。Transwell實驗觀察PBS、rAAV-EGFP及rAAV-HGFK1治療后，前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3細(xì)胞侵襲能力的變化情況。 （4）轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機(jī)制的初步研究：RT-PCR方法了解PBS、rAAV-EGFP及rAAV-HGFK1治療后，轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 一、體內(nèi)實驗結(jié)果（1） 移植瘤種植情況觀察：左下肢脛骨平臺處注射PC3細(xì)胞4周后，經(jīng)病理組織學(xué)檢

6、查確認(rèn)全部成瘤。
　　 （2） 腫瘤生長情況觀察：導(dǎo)入的HGFK1基因?qū)δ[瘤生長有明顯的抑制作用，抑瘤率達(dá)46.69％。
　　 （3）裸鼠生存時間觀察：裸鼠的生存時間明顯延長，PBS和rAAV-EGFP對照組中位生存時間分別為47 天和49天，而rAAV-HGFK1治療組的中位生存時間為 68天。rAAV-HGFK1治療組與兩對照組之間的差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。
　　 （4）轉(zhuǎn)移情況觀察：在對照的

7、PBS注射組和rAAV-EGFP注射組，腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率均是100％。而治療組卻僅有20％。rAAV-HGFK1治療組與兩對照組之間的差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。
　　 （5）病理組織學(xué)觀察：光鏡下的觀察證實了rAAV-HGFK1對腫瘤細(xì)胞增值、轉(zhuǎn)移以及腫瘤內(nèi)血管生成的抑制作用。
　　 一、體外實驗結(jié)果
　　 （1） 腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞情況觀察：PC3細(xì)胞轉(zhuǎn)染rAAV-EGFP72小時后，

8、綠色螢光蛋白的表達(dá)率為:39％，rAAV-HGFK1轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞72小時后，RT-PCR法觀察發(fā)現(xiàn)，HGFK1mRNA明顯表達(dá)。
　　 （2） PC3細(xì)胞增殖情況觀察：生長曲線觀察發(fā)現(xiàn)rAAV-HGFK1治療組PC3細(xì)胞增殖較PBS組及rAAV-HGFK1治療組顯著減慢。
　　 （3） PC3細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力觀察：傷口劃痕實驗及Transwell實驗觀察發(fā)現(xiàn)rAAV-HGFK1治療組PC3細(xì)胞遷移侵襲能力較PBS組及rAA

9、V-HGFK1治療組顯著降低。
　　 （4）PC3細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的觀察：RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)rAAV-HGFK1治療組尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑（urokinase type plasminogen activator，uPA）及甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(Parathyroid hormone-related protein,PTHrP) mRNA水平的表達(dá)較PBS組及rAAV-HGFK1治療組顯著降低。
　　 結(jié)論

10、：
　　 （1）HGFK1在體內(nèi)及體外均明顯地抑制了骨髓微環(huán)境內(nèi)前列腺癌腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移能力，體內(nèi)腫瘤血管生長也受到了明顯的抑制。
　　 （2）荷瘤裸鼠的生存時間顯著延長。
　　 （3）HGFK1治療使得PC3細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移相關(guān)分子uPA及PTHrP mRNA水平的表達(dá)顯著降低，提示HGFK1在體內(nèi)及體外試驗中表現(xiàn)出來的轉(zhuǎn)移抑制作用可能與此二者的表達(dá)受抑制有關(guān)。
　　 （4）該研究提示HGFK1為前列腺癌