表達(dá)分泌SAC融合肽的重組AAV對(duì)前列腺癌CAM移植瘤的治療作用研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 前列腺癌是男性泌尿、生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)近年來(lái)前列腺癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。雄激素阻斷療法(ADT)是目前臨床治療前列腺癌及其轉(zhuǎn)移癌的重要手段，但幾乎所有阻斷雄激素治療的患者最終都發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌(CRPC)，ADT不敏感且預(yù)后較差。前列腺凋亡反應(yīng)基因4(par-4)是一種促凋亡基因，其選擇性癌細(xì)胞凋亡結(jié)構(gòu)域SAC能在不依賴凋亡刺激的情況下，同時(shí)誘導(dǎo)雄激素依賴性和非依賴性前列腺癌細(xì)胞凋亡，

2、而不損害正常細(xì)胞，表現(xiàn)出良好的腫瘤靶向殺傷效應(yīng)。腺相關(guān)病毒（AAV）具有免疫原性低、安全性好、沒(méi)有炎性反應(yīng)、可同時(shí)轉(zhuǎn)染分裂和非分裂細(xì)胞及長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)目的基因等優(yōu)點(diǎn)，在基因治療載體研究中受到廣泛關(guān)注。雞胚絨毛尿囊膜(CAM)是由胚齡4-5d雞胚的絨毛膜體壁中胚層和尿囊膜臟層中胚層融合而成，胚齡6-7d后CAM及其血管覆蓋整個(gè)卵黃囊表面，且隨著胚齡的增加而增大，毛細(xì)血管極其豐富，CAM是天然免疫缺陷宿主，可耐受一定的溫度變化，適于移植性腫瘤

3、的生長(zhǎng)和生物學(xué)行為觀測(cè)，常作為移植性腫瘤的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　 基于SAC對(duì)前列腺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)機(jī)制及應(yīng)用AAV載體，我們?cè)谇捌谘芯恐谐晒?gòu)建引入了真核信號(hào)肽神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素4(NT4)和穿膜肽HIV-1反式激活蛋白(TAT)的SAC基因重組腺相關(guān)病毒載體rAAV-NT4-SAC-HA2-TAT，本研究旨在建立前列腺癌的CAM移植瘤模型，并將表達(dá)分泌SAC融合肽的重組腺相關(guān)病毒作用于移植瘤，觀察其表達(dá)產(chǎn)物SAC融合肽對(duì)前列腺癌CAM移植

4、瘤的抑制作用。
　　 材料與方法：
　　 1.將前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇和培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，離心并用PBS緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度為5～8×106個(gè)/20μL。取孵育9d健康種雞卵，酒精擦拭卵殼消毒，氣室端開(kāi)窗，撕去內(nèi)殼膜暴露絨毛尿囊膜，然后將調(diào)整好濃度的PC-3細(xì)胞接種到雞胚絨毛尿囊膜上，透明膠帶封閉窗口繼續(xù)孵育。密切觀察移植瘤的生長(zhǎng)及誘導(dǎo)血管生成情況。
　　 2.接種后第3天，選取成瘤較好（瘤直徑

5、≥3mm）且生長(zhǎng)良好的雞胚，隨機(jī)分為3組，每組8只，給予下述不同處理，即空白對(duì)照組（PBS組:PBS，100μL/只）、空病毒組(AAV組:AAV，1×109cfu/100μL/只)、重組病毒組(rAAV組:rAAV-NT4-SAC-HA2-TAT，1×109cfu/100μL/只)。在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)按上述設(shè)計(jì)將相應(yīng)試劑滴于移植瘤上，透明膠布封窗，繼續(xù)37℃、60％～70％濕度溫箱孵育。觀察移植瘤生長(zhǎng)情況，處理4d后測(cè)量各組移植瘤的大小，

6、并完整剝離腫瘤，石蠟包埋、切片，免疫熒光法檢測(cè)目的基因表達(dá)，根據(jù)瘤體積及HE染色比較各組作用效果。
　　 結(jié)果：
　　 1.癌細(xì)胞接種于CAM后呈彌散樣分布，接種24h后可見(jiàn)接種區(qū)CAM粗糙變厚，邊界清楚。2d后接種區(qū)可見(jiàn)明顯白色瘤團(tuán)，但瘤周圍毛細(xì)血管聚集尚不明顯。3d后瘤體進(jìn)一步增大，呈團(tuán)狀生長(zhǎng)，可見(jiàn)少量毛細(xì)血管聚集。
　　 2.給予處理后PBS組及AAV組移植瘤繼續(xù)生長(zhǎng)，可見(jiàn)毛細(xì)血管環(huán)形聚集，以瘤體為中心呈彌

7、漫、放射狀分布。rAAV組移植瘤生長(zhǎng)情況總體觀察明顯小于對(duì)照組。對(duì)3組移植瘤體積測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示:PBS組、AAV組分別與rAAV組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);AAV組與PBS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)SAC融合肽表達(dá)。HE染色鏡下見(jiàn)PBS組、AAV組移植瘤生長(zhǎng)狀態(tài)相似，瘤細(xì)胞呈條索狀浸潤(rùn)生長(zhǎng)，同時(shí)伴有新生血管形成，表現(xiàn)出高度侵襲能力;rAAV組移植瘤受到明顯生長(zhǎng)抑制，瘤細(xì)胞孤立成團(tuán)，邊