力生長因子E肽(MGF-Ct24E)與應(yīng)力作用對成骨細(xì)胞基因表達(dá)影響的基因芯片分析.pdf

1、最近力生長因子（Mechanogrowthfactor,MGF）是生物力學(xué)及生長因子研究方面的新熱點。MGF是Igf-1基因的選擇性剪接變異體，在拉伸刺激的骨骼肌和損傷的神經(jīng)、肌肉等組織中高表達(dá)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MGF及其E肽（MGF-Ct24E）能夠促進肌肉肥大，損傷修復(fù)，并且具有神經(jīng)保護和心肌保護等功能。本實驗室的研究發(fā)現(xiàn)在拉伸刺激的成骨細(xì)胞中也有MGFmRNA的高表達(dá)，提示MGF也可能是骨組織中響應(yīng)力信號的效應(yīng)因子，還發(fā)現(xiàn)MGF能

2、夠調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖分化過程，促進骨缺損修復(fù)作用。應(yīng)力在骨組織的生長、重建過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，骨折損傷部位往往因為缺乏應(yīng)力而導(dǎo)致愈合后的骨質(zhì)疏松甚至再骨折現(xiàn)象。因此，本課題比較分析應(yīng)力與MGF-Ct24E作用后成骨細(xì)胞的基因表達(dá)譜，尋找兩者在骨代謝調(diào)控方面的異同，設(shè)想以MGF代替應(yīng)力解決骨損傷修復(fù)過程因固定醫(yī)療措施使得應(yīng)力嚴(yán)重降低的問題。
　　主要內(nèi)容和結(jié)論如下：
　?。?）運用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)出新生大鼠顱骨成骨細(xì)胞

3、，利用差時黏附法對培養(yǎng)出的細(xì)胞進行純化。通過形態(tài)學(xué)觀察、堿性磷酸酶（ALP）染色、基質(zhì)前體染色、礦化結(jié)節(jié)染色等鑒定方法證實該組織塊法培養(yǎng)的細(xì)胞具有典型的成骨細(xì)胞生物學(xué)特征，符合后續(xù)實驗要求。將傳代培養(yǎng)至第三代的成骨細(xì)胞用于后續(xù)實驗研究。
　　（2）對細(xì)胞施加12％的周期性拉伸刺激和50ng/mLMGF-Ct24E直接作用8h，以靜態(tài)培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組，提取細(xì)胞總RNA，進行基因芯片雜交實驗分析各組細(xì)胞的差異表達(dá)基因。以對照組為參

4、照，在力學(xué)加載組的細(xì)胞中共發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因1866條，其中上調(diào)1113條，下調(diào)753條；在MGF-Ct24E處理組的細(xì)胞中共發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因1178條，其中上調(diào)基因796條，下調(diào)基因382條。以力學(xué)加載組為參照，分析MGF-Ct24E處理組的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因共602條，其中上調(diào)基因290條，下調(diào)基因312條。
　　（3）應(yīng)用GeneOntology(GO)數(shù)據(jù)庫對篩選出的差異表達(dá)基因進行基因本體論分析，分類分析各差異表達(dá)基因的

5、功能類型。應(yīng)力和MGF-Ct24E作用成骨細(xì)胞后，得到的差異表達(dá)基因所參與調(diào)控的GO類型有眾多相似之處。這些共同之處主要是關(guān)于細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞周期、骨發(fā)育和骨化的調(diào)節(jié)，細(xì)胞遷移及對應(yīng)力刺激的響應(yīng)等。除了兩者共同調(diào)節(jié)的表達(dá)類型外，應(yīng)力作用后的差異表達(dá)基因還參與調(diào)控了肌動蛋白細(xì)胞骨架組織、細(xì)胞生長、蛋白區(qū)域特異性結(jié)合和蛋白質(zhì)二聚化活性等；MGF-Ct24E作用后的差異表達(dá)基因還參與調(diào)控了軟骨發(fā)育、細(xì)胞骨架、生長因子結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合和受

6、體結(jié)合等。以力學(xué)加載組為參照，分析MGF-Ct24E處理組的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)MGF-Ct24E處理組中的差異表達(dá)基因主要與胚胎和組織發(fā)育、轉(zhuǎn)錄與基因表達(dá)的正調(diào)節(jié)等有關(guān)。MGF-Ct24E處理組與力學(xué)加載組的差異表達(dá)基因在調(diào)控骨代謝方面有很高的相似性,其差異基因表達(dá)的變化趨勢與差異表達(dá)倍數(shù)也基本一致。
　?。?）通過細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期分析和細(xì)胞分化檢測等實驗進一步分析了MGF-Ct24E對成骨細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。結(jié)果顯示：MGF-

7、Ct24E在成骨細(xì)胞生長早期促進了細(xì)胞的增殖，抑制了ALP活性；細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)MGF-Ct24E作用組在第一天和第三天S期的細(xì)胞所占比例顯著高于對照組，細(xì)胞增殖指數(shù)顯著提高，隨著培養(yǎng)時間的延長增殖速度逐漸減緩，促增殖效率逐漸降低；在細(xì)胞分化晚期，MGF-Ct24E促進了膠原的表達(dá)和礦化結(jié)節(jié)的形成，促進了成骨細(xì)胞的分化。說明MGF-Ct24E并非是抑制成骨細(xì)胞的分化，而是促進成骨細(xì)胞早期的增殖活性，延遲了其分化活性。細(xì)胞實驗所得結(jié)果與基