融合蛋白亞單位疫苗對結核分枝桿菌感染豚鼠和小鼠免疫治療效果的初步評價.pdf

1、背景：
　　由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的、主要經呼吸道傳播的結核病(tuberculosis,TB)是目前世界范圍內造成死亡人數最多的傳染病。卡介苗(Bacillus Calmette Guerin,BCG)的接種雖然能夠有效預防兒童TB的發(fā)生,但是無法防止成人的TB感染和潛伏感染的復發(fā)。由于對疫苗作用機制和MTB致病機制研究緩慢,使得研發(fā)比BCG更為安全有效的預防疫苗極

2、其困難。TB化療中使用的異煙肼(Isoniazid acid hydrazide,INH)、利福平(Rifampicin,RFP)等藥物主要針對生長活躍的MTB,對生長緩慢、代謝遲緩的MTB休眠菌的殺傷效果不明顯,而且化療存在治療周期長、毒副作用大、患者依從性較差等問題,加之TB耐藥形式的日益嚴峻,因此迫切需要研發(fā)新型的抗TB藥物和療法。治療性疫苗的接種可刺激機體產生特異性的抗MTB免疫應答,有助于提高免疫系統對持留菌的識別和清除,從而

3、縮短療程,是目前TB研究的重要方向之一。
　　目的：
　　建立MTB感染豚鼠模型,在此模型中評價融合蛋白Ag85B-ESAT-6+Hsp65-hIL-2組合 MPLA佐劑的亞單位疫苗單獨和聯合化療藥物的治療效果及抑制 MTB感染復發(fā)的能力;建立MTB感染小鼠模型,在此模型中評價上述亞單位疫苗的單獨治療和聯合化療藥物治療的效果。
　　實驗方法和結果：
　　一、融合蛋白Ag85B-ESAT-6的免疫學特性研究

4、　　方法:使用原核表達系統分別表達Ag85B-ESAT-6和Hsp65-hIL-2,Ni2+離子親和層析法純化目的蛋白。以不同劑量(20μg、50μg、100μg、200μg、600μg) Ag85B-ESAT-6重組蛋白分別與50μg單磷酰脂質A(MPLA)佐劑混合后皮下多點注射方式免疫豚鼠,共免疫3次,每次間隔3周。每次免疫后2周取血分離血清,ELISA法檢測免疫豚鼠血清特異性IgG抗體及IgG1和IgG2亞類滴度;末次免疫后2周處

5、死豚鼠,分離外周血白細胞,流式細胞術檢測外周血CD4+和CD8+T細胞比例。
　　結果:純化獲得了純化的重組融合蛋白Ag85B-ESAT-6和Hsp65-hIL-2;以20μg Ag85B-ESAT-6免疫2次即可誘導豚鼠產生較高水平的IgG抗體;3次免疫后,豚鼠外周血CD4+和CD8+T細胞比例均有所下降。
　　二、融合蛋白亞單位疫苗對MTB感染豚鼠免疫治療效果的評價
　　方法:以105CFU MTB H37Rv經腹

6、股溝皮下注射感染豚鼠,6周后平板計數法檢測感染豚鼠肺臟和脾臟荷菌量,確立模型建立。之后將感染豚鼠分為感染未治療組、免疫治療組、化療組、化療聯合免疫治療組;另設未感染豚鼠正常對照組。化療自感染后第6周開始,采用INH和RFP聯用飲水治療,飲水中藥物濃度為108.5 mg/L INH、105 mg/L RFP,每周飲用5天,連續(xù)治療11周;免疫治療采用背部皮下接種,間隔一天給予10μg Ag85B-ESAT-6+10μg Hsp65-hIL

7、-2+5μg MPLA免疫兩次,3周后以同樣方法和劑量給予第二次免疫;全部治療結束后(即感染第17周)給予各組豚鼠腹腔注射地塞米松1mg/只,每周3次,持續(xù)4周,以此進行免疫抑制誘導感染復發(fā)。實驗過程中每周記錄豚鼠體重;分次采血并檢測血清特異性IgG抗體及IgG1和IgG2亞類水平;HE染色觀察肺組織病理變化;流式細胞術檢測外周血和脾臟CD4+和CD8+T細胞比例,總T和B細胞亞群比例;免疫治療完成后4周(感染后17周)和免疫抑制完成后

8、4周(感染后25周)處死豚鼠,平板計數法檢測肺臟和脾臟荷菌量。
　　結果:感染6周時豚鼠肺臟和脾臟出現肉眼可見的結核結節(jié),荷菌量分別為5.82±0.29 lgCFU和6.53±0.33 lgCFU,表明豚鼠感染模型建立成功。感染10周后,未治療組豚鼠體重停止增長,免疫治療組豚鼠在免疫抑制后體重下降明顯,至感染20周全部死亡;免疫治療組和化療聯合免疫治療組豚鼠血清中抗MTB特異性IgG水平顯著高于感染未治療組(P<0.001,P<0

9、.001),且MTB特異性抗體的升高是以IgG2亞類為主;感染未治療組豚鼠肺組織呈現嚴重炎癥病變,而藥物治療組和化療聯合免疫治療組的豚鼠病理改變較輕;與感染未治療組相比,免疫治療和化療聯合免疫治療組豚鼠外周血和脾臟T細胞水平呈上升趨勢,其中CD8+T細胞比例上升較明顯;治療結束后,免疫治療組、化療組和化療聯合免疫治療組肺臟荷菌量均顯著低于感染未治療組(P<0.05,P<0.05,P<0.01),化療組和化療聯合免疫治療組豚鼠脾臟荷菌量顯

10、著低于感染未治療組(P<0.01,P<0.01),免疫抑制后,化療聯合免疫治療組豚鼠肺臟荷菌量顯著低于化療組(P<0.05)。
　　三、融合蛋白亞單位疫苗對MTB感染小鼠免疫治療效果的評價
　　方法:以105 CFU MTB H37Rv尾靜脈注射感染C57BL/6J小鼠,4周后平板計數法檢測感染小鼠肺臟和脾臟荷菌量,確立模型建立。之后將小鼠分為感染未治療組、免疫治療組、半程化療組、半程化療聯合免疫治療組、全程化療組、全程化療

11、聯合免疫治療組;另設未感染小鼠正常對照組?；熥愿腥竞?周開始,采用INH和RFP聯用飲水治療(方法和劑量同上述豚鼠治療實驗),其中半程藥物治療時間持續(xù)4周,全程藥物治療持續(xù)11周;免疫治療采用背部皮下接種5μg Ag85B-ESAT-6+5μg Hsp65-hIL-2+5μg MPLA,在感染后第8周進行第一次免疫,3周后(感染后第11周)給予第二次免疫。治療結束后處死豚鼠分離脾淋巴細胞,流式細胞術檢測MTB抗原刺激后表達IFN-γ、

12、IL-2、IL-4和TNF-α四種細胞因子的CD4+和CD8+T脾淋巴細胞的比例;平板計數法檢測小鼠肺臟和脾臟荷菌量。
　　結果:感染4周時小鼠肺臟和脾臟荷菌量分別為3.67±0.10 lgCFU和3.54±0.14 lgCFU,表明小鼠感染模型建立成功。與正常對照組小鼠相比,感染未治療組和免疫治療組小鼠脾淋巴細胞在MTB抗原刺激培養(yǎng)后表達IFN-γ的CD4+T細胞比例顯著升高(P<0.001,P<0.001);感染未治療組和免疫

13、治療組表達IL-2的CD4+T細胞比例顯著高于正常對照組(P<0.01,P<0.01),半程化療聯合免疫治療組以及全程化療聯合免疫治療組該比例分別顯著高于相應的半程化療組和全程化療組(P<0.001,P<0.001);各感染組表達IL-4的CD4+ T細胞比例總體呈下降趨勢;全程化療聯合免疫治療組表達TNF-α的CD4+T細胞比例顯著低于全程化療組(P<0.001)。各組間表達IFN-γ的CD8+T細胞比例無顯著差異,感染未治療組和免疫

14、治療組表達IL-2的CD8+T細胞比例顯著升高(P<0.001,P<0.001);半程化療聯合免疫治療組和全程化療聯合免疫治療組該比例分別顯著高于半程化療組和全程化療組（P<0.001,P<0.01);感染未治療組和免疫治療組表達IL-4的CD8+T細胞比例均顯著上升,半程化療聯合免疫治療組該比例高于半程化療組(P<0.05);半程化療組和半程化療聯合免疫治療組停止化療后體內荷菌量出現回升但相對緩慢,與感染未治療組和化療組相比,相應的免

15、疫治療組和化療聯用免疫治療組小鼠臟器荷菌量均無顯著差異。
　　結論
　　Ag85B-ESAT-6和Hsp65-hIL-2組合MPLA佐劑的亞單位疫苗可有效刺激感染豚鼠產生抗MTB的特異性抗體,提高豚鼠外周血和脾臟T細胞比例,顯著降低感染豚鼠肺臟荷菌量,并且與化療聯合應用后可有效抑制治療后MTB感染復發(fā)。
　　該疫苗能夠拮抗MTB感染小鼠模型中化療所引起的分泌IL-2的CD4+和CD8+T細胞比例的降低,免疫治療聯合化療