肝卵圓細胞在局部微環(huán)境中通過EMT表現(xiàn)上皮-間葉可塑性的研究.pdf

1、第一部分大鼠2-AAF/PH模型中肝卵圓細胞的增殖模型的建立以及肝卵圓細胞的分離、鑒定及培養(yǎng)
　　 目的:建立大鼠2-AAF/PH 肝卵圓細胞增殖模型，探討其分離、鑒定和培養(yǎng)的方法。
　　 方法:大鼠每天灌喂2-乙酰氨基芴，劑量為15mg/kg，第5天停藥并在10％水合氯醛全麻下行2/3 大部肝切除術。第6天繼續(xù)喂藥，連續(xù)一周。對照組只是用生理鹽水代替2-乙酰氨基芴，其余步驟一樣。分別于手術后第2、6、10、12、16、

2、21天麻醉后頸椎脫臼法處死大鼠取肝臟標本，每個時間點取3只大鼠，繪制肝卵圓細胞增殖曲線圖；取肝卵圓細胞增殖高峰期大鼠，采用改良的二步膠原酶灌注消化加密度梯度離心法分離肝卵圓細胞，用流式細胞儀、細胞免疫熒光、透射電鏡鑒定肝卵圓細胞。
　　 結(jié)果:2-AAF/PH模型成功誘導肝卵圓細胞增殖，同時還發(fā)現(xiàn)肝卵圓細胞的增殖高峰在術后10天左右，對照組無肝卵圓細胞出現(xiàn)。分離的肝卵圓細胞呈鋪路石樣生長，流式細胞儀檢測OV6 陽性細胞占85.3

3、6％±7％，細胞免疫熒光顯示細胞表達肝卵圓細胞標志物OV6，AFP，CK19，ALB，C-kit，透射電鏡顯示核漿比大，胞漿內(nèi)細胞器少，表現(xiàn)為不成熟細胞特性。
　　 結(jié)論:2-AAF/PH模型成功誘導肝卵圓細胞增殖，肝卵圓細胞增殖頂峰在術后10天左右，改良的兩步膠原酶灌注消化加梯度密度離心法可以分離出純度較高的肝卵圓細胞，為后續(xù)研究肝卵圓細胞的性質(zhì)奠定了基礎。
　　 第二部分 EMT 參與的肝卵圓細胞皮下接種裸鼠轉(zhuǎn)分化為

4、間葉組織瘤\
　　 目的:建立肝卵圓細胞種植到裸鼠皮下模型，研究肝卵圓細胞的可塑性。
　　 方法:將大鼠肝卵圓細胞系LE/6細胞種植到50只雌性裸鼠皮下，觀察有無腫塊生長，HepG2細胞做陽性對照接種到5只裸鼠皮下。腫塊通過HE 染色，免疫組化，透射電鏡，熒光原位雜交，激光共聚焦以及Western blot 鑒定其性質(zhì)。
　　 結(jié)果:50只裸鼠有22只生成皮下腫塊（陽性率44％），對照組5只全部生成皮下腫瘤（陽性

5、率100％）。HE 染色顯示LE/6細胞生成的腫塊結(jié)構和HepG2 形成的腫瘤完全不同，前者更像間葉組織瘤，免疫組化顯示腫塊表達間葉組織標志物vimentin，SMA，desmin和S-100，透射電鏡找到間葉組織特異性標志物致密體，熒光原位雜交確定了腫塊來源于接種的LE/6細胞，激光共聚焦顯示Snail和vimentin，snail和N-cadherin共表達，Western blot 顯示Snail、vimentin和N-cadhe

6、rin 高表達，而E-cadherin 低表達。
　　 結(jié)論:肝卵圓細胞接種到裸鼠皮下能轉(zhuǎn)分化為間葉組織瘤，EMT 參與了這一轉(zhuǎn)變過程，肝卵圓細胞在局部微環(huán)境刺激下具有很強的可塑性。
　　 第三部分：肝卵圓細胞皮下接種形成的間葉組織瘤移植入肝臟的轉(zhuǎn)分化
　　 目的：探討肝卵圓細胞皮下接種形成的間葉組織瘤再種植入肝臟，長期觀察肝卵圓細胞衍生的間葉組織瘤能否轉(zhuǎn)分化為肝癌組織。
　　 方法：肝卵圓細胞種植裸鼠腋

7、下皮膚形成間葉組織瘤后，在移植到20只雌性裸鼠肝實質(zhì)內(nèi)，觀察裸鼠腹部變化，對照組直接注射肝卵圓細胞到裸鼠肝實質(zhì)內(nèi)。取肝內(nèi)形成的腫瘤做HE、免疫組化、透射電鏡，明確腫瘤性質(zhì)。
　　 結(jié)果：20只接種間葉組織瘤的裸鼠有3只形成肝內(nèi)腫瘤（成瘤率15％），對照組無一只裸鼠形成肝內(nèi)腫瘤。HE 染色可見肝內(nèi)腫瘤由大部分的間葉細胞和少量異型上皮樣細胞組成，免疫組化顯示間葉細胞表達vimentin和SMA，而異型上皮細胞則表達肝細胞標志物Hep