自噬對(duì)肝卵圓細(xì)胞在缺血缺氧微環(huán)境中增殖的影響.pdf

1、目的:
　　觀察缺血缺氧微環(huán)境對(duì)肝卵圓細(xì)胞(hepatic oval cell，HOC)自噬的誘導(dǎo)，觀察自噬對(duì)HOC在缺血缺氧微環(huán)境中增殖和分化能力的影響，通過對(duì)自噬抑制前后體外培養(yǎng)的肝卵圓細(xì)胞增殖和分化能力情況觀察，發(fā)現(xiàn)自噬對(duì)肝卵圓細(xì)胞功能維持的重要性以及自噬誘發(fā)肝腫瘤的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.缺血缺氧模型的建立和分組。
　　將肝卵圓細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80％～90％時(shí)，棄舊培養(yǎng)基，加入無血清

2、1640培養(yǎng)基，放入密封培養(yǎng)罐后迅速放入AnaeroPack（安寧包）產(chǎn)氣袋一袋和氧氣指示劑一枚，密封，45min后開始計(jì)時(shí)。分別缺血缺氧0，2，4，8和24h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置單純?nèi)毖毖跞毖踅M(ischemia-hypoxia組)，缺氧前用20umol/L氯喹(CQ)預(yù)處理肝卵圓細(xì)胞1h作為缺血缺氧+氯喹(ischemia-hypoxia+CQ組)，同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照(control組)即缺血缺氧0h組，和單純加入20umol/L氯喹的

3、對(duì)照組。
　　2.肝卵圓細(xì)胞在缺血缺氧微環(huán)境中的增殖和分化能力變化觀察。在缺血缺氧微環(huán)境中培養(yǎng)HOC0、2、4、6、8、10和24 h后應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測比較肝卵圓細(xì)胞的增殖能力變化，并觀察肝卵圓細(xì)胞形態(tài)變化。
　　3.肝卵圓細(xì)胞在缺血缺氧微環(huán)境條件下自噬水平變化檢測。將分離純化培養(yǎng)的大鼠肝卵圓細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，通過無血清培養(yǎng)基和1％氧氣條件下培養(yǎng)0、2、4、8和24h，不同時(shí)間點(diǎn)分別收集細(xì)胞，通過免疫熒光細(xì)胞化學(xué)

4、染色法觀察細(xì)胞自噬情況，運(yùn)用Western Blot法檢測LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白水平;應(yīng)用丹（磺）酰戊二胺(Monodansylcadaverine，MDC)染色熒光定位法，觀察綠色點(diǎn)狀熒光的數(shù)量和分布，觀察缺血和缺氧培養(yǎng)后不同時(shí)間點(diǎn)自噬水平的變化。
　　4.抑制自噬對(duì)肝卵圓細(xì)胞在缺血缺氧微環(huán)境中增殖分化潛能的影響觀察。運(yùn)用經(jīng)典自噬抑制劑氯喹抑制細(xì)胞自噬后運(yùn)用CCK-8試劑盒檢測比較肝卵圓細(xì)胞的增殖能力變化，并觀察肝卵圓細(xì)胞形

5、態(tài)變化，并與自噬未抑制前比較。
　　5.抑制自噬后肝卵圓細(xì)胞在缺血缺氧微環(huán)境條件下自噬水平變化檢測。運(yùn)用自噬抑制劑氯喹抑制細(xì)胞自噬，通過免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法觀察細(xì)胞自噬情況，運(yùn)用Western Blot法檢測LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白水平;應(yīng)用丹（磺）酰戊二胺(Monodansylcadaverine，MDC)染色熒光定位法，觀察點(diǎn)狀熒光顆粒的數(shù)量和分布，觀察自噬被抑制后細(xì)胞在缺血和缺氧培養(yǎng)后不同時(shí)間點(diǎn)自噬水平的變化，并與自噬未

6、抑制前比較。
　　6.運(yùn)用Hoechst33258染色觀察抑制自噬前后細(xì)胞凋亡情況。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)，兩樣本比較采用成組t檢驗(yàn)，組間差異比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.肝卵圓細(xì)胞在缺血缺氧微環(huán)境條件下培養(yǎng)0、2、4、8和24 h后，從2h開始隨著缺血缺氧時(shí)間的延長，肝卵圓細(xì)胞的存活率明顯下降，細(xì)

7、胞形態(tài)變化也越來越明顯。
　　2.肝卵圓細(xì)胞經(jīng)處理后，與對(duì)照組相比，隨著缺血缺氧的時(shí)間的延長，細(xì)胞免疫熒光觀察到肝卵圓細(xì)胞胞漿LC3表達(dá)量顯著上升，Western Blot法檢測到缺血缺氧作用細(xì)胞后LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比值和LC3-Ⅱ的表達(dá)都顯著增加。
　　3.丹（磺）酰戊二胺(Monodansylcadaverine，MDC)染色熒光檢測，激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，缺血缺氧誘導(dǎo)大量熒光顆粒分布于肝卵圓細(xì)胞胞漿及核周，顯

8、著高于正常對(duì)照細(xì)胞，以及自噬抑制前明顯高于抑制后。
　　4.加入氯喹后，細(xì)胞在缺血缺氧微環(huán)境條件下的存活率較加入前明顯下降。
　　5.Hoechst33258染色觀察顯示:隨著缺血缺氧時(shí)間延長凋亡細(xì)胞增加。缺血缺氧處理相同時(shí)間比較，抑制自噬后比抑制前凋亡細(xì)胞明顯增多，凋亡特征更明顯。
　　結(jié)論:
　　1.CCK-8結(jié)果顯示肝卵圓細(xì)胞在缺血缺氧微環(huán)境中存活率下降，說明缺血缺氧可以抑制細(xì)胞增殖。
　　2.細(xì)胞免

9、疫熒光觀察到肝卵圓經(jīng)缺血缺氧處理后細(xì)胞胞漿LC3表達(dá)量顯著上升，Western Blot法檢測到缺血缺氧作用細(xì)胞后LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比值和LC3-Ⅱ的表達(dá)都顯著增加，說明缺血缺氧微環(huán)境可以誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞發(fā)生自噬。
　　3.MDC染色熒光檢測結(jié)果也支持缺血缺氧微環(huán)境可以誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞發(fā)生自噬。
　　4.抑制自噬后，細(xì)胞在缺血缺氧微環(huán)境條件下的存活率較抑制前明顯下降，及Hoechst33258染色觀察結(jié)果說明自噬有利于肝卵