腸道免疫系統(tǒng)中巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞之間的相互作用及機(jī)制.pdf

1、研究目的：
　　腸道是機(jī)體內(nèi)環(huán)境與外界直接交流的主要界面。腸道黏膜免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵御腸道病原體感染的第一道防線。小腸固有層是腸道免疫系統(tǒng)主要的效應(yīng)位點(diǎn)，其中包含大量的巨噬細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等，在早期抵抗腸道病原菌過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。其中巨噬細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生活性氧中間體和活性氮中間體等物質(zhì)，在清除胞內(nèi)寄生菌的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的殺菌作用。CD4+T細(xì)胞可以通過(guò)分泌IFN-γ促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化，但在腸道黏膜免疫系統(tǒng)抵抗外來(lái)病原體

2、感染的過(guò)程中，二者是否存在相互調(diào)節(jié)及其在抗感染中的作用和機(jī)制，目前研究尚少。
　　本研究以鼠傷寒沙門氏菌腸道感染模型，觀察小腸固有層巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的活化及其在抗細(xì)菌感染中的作用，并探討二者間是否存在相互調(diào)節(jié)作用及機(jī)制，將為腸道感染及炎癥修復(fù)等疾病提供新的治療策略和思路。
　　方法:
　　首先，我們采用灌胃的方法建立了腸道感染鼠傷寒沙門氏菌動(dòng)物模型;運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠小腸固有層淋巴細(xì)胞各亞群的比例、數(shù)量和活

3、化的變化。
　　其次，為了研究腸道巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞在抵抗外來(lái)病原菌入侵時(shí)是否存在相互調(diào)節(jié)作用，我們分別利用特異性清除抗體清除小鼠CD4+T細(xì)胞、利用Cl2MDP脂質(zhì)體清除巨噬細(xì)胞，觀察清除CD4+T細(xì)胞對(duì)感染小鼠巨噬細(xì)胞數(shù)量和活化的變化及清除巨噬細(xì)胞對(duì)感染小鼠CD4+T細(xì)胞的數(shù)量和活化的變化。
　　再次，我們分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，體外感染鼠傷寒沙門氏菌后，與CD4+T細(xì)胞共孵育，同時(shí)加入α-乳糖特異性阻斷galect

4、in-9與Tim-3的結(jié)合，然后觀察巨噬細(xì)胞的載菌量、活化、分泌細(xì)胞因子水平和CD4+T細(xì)胞的活化、分泌細(xì)胞因子、凋亡的變化。
　　最后，我們運(yùn)用Westernblot技術(shù)檢測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外感染鼠傷寒沙門氏菌后炎性小體NLRP3和NLRC4以及caspase-1的蛋白表達(dá)水平，利用Westernblot、ELISA和FACS等多種技術(shù)檢測(cè)IL-1β的表達(dá)變化。另外，我們觀察了加入IL-1β中和抗體后感染的巨噬細(xì)胞與CD4+T

5、細(xì)胞共孵育后的載菌量變化及外加IL-1β對(duì)感染后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞載菌量和galectin-9表達(dá)的影響。初步探究了galectin-9和Tim-3信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞之間的相互作用中所發(fā)揮的作用。
　　結(jié)果:
　　1.小腸固有層F4/80+CD11c+巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞在感染后數(shù)量和活化均明顯增加
　　我們我們首先建立了鼠傷寒沙門氏菌腸道感染模型，并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了感染第1、3、5、7天小腸固

6、有層部位各淋巴細(xì)胞亞群的比例、數(shù)量和活化的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著感染天數(shù)的增加，小腸固有層F4/80+CD11b+巨噬細(xì)胞的比例有所增加。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)一群表型為F4/80+CD11c+的巨噬細(xì)胞，其在固有層中的比例和數(shù)量的增加更為明顯。同時(shí)我們也觀察到了CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在感染后數(shù)量增加，但僅有CD4+T細(xì)胞活化明顯增強(qiáng)。提示這兩種細(xì)胞在清除鼠傷寒沙門氏菌的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　2.清除CD4+T細(xì)胞明顯削弱小腸

7、固有層巨噬細(xì)胞的活化
　　我們通過(guò)抗體清除實(shí)驗(yàn)清除小鼠CD4+T細(xì)胞，然后比較清除組和未清除組感染后小腸固有層巨噬細(xì)胞的數(shù)量及活化的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，清除CD4+T細(xì)胞小鼠感染后肝、脾、MLN組織載菌量高于未清除組，腸道巨噬細(xì)胞的活化和IL-1β的分泌均低于未清除組。
　　3.清除巨噬細(xì)胞明顯削弱小腸固有層CD4+T細(xì)胞的活化
　　我們利用Cl2MDP脂質(zhì)體清除小鼠巨噬細(xì)胞，然后比較清除組和未清除組感染后小腸固有層CD4

8、+T細(xì)胞的數(shù)量及活化的變化。我們發(fā)現(xiàn)，清除組小鼠感染后肝、脾、MLN組織載菌量高于未清除組，腸道CD4+T細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子分泌均低于未清除組。
　　4.α-乳糖阻斷galectin-9-Tim-3的結(jié)合影響巨噬細(xì)胞的殺菌功能
　　為了驗(yàn)證galectin-9和Tim-3信號(hào)通路參與了腸道巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞之間的相互作用，我們?cè)诰奘杉?xì)胞和CD4+T細(xì)胞體外共孵育實(shí)驗(yàn)中加入不同濃度α-乳糖以阻斷galectin-9與T

9、im-3的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)隨著α-乳糖濃度的升高巨噬細(xì)胞的載菌量和IL-1β的分泌均明顯下降;而CD4+T細(xì)胞的活化沒(méi)有受到明顯影響，但其凋亡隨著α-乳糖濃度的升高而降低。提示galectin-9和Tim-3信號(hào)通路參與了腸道巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞之間的相互作用，而且這一信號(hào)通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞的殺菌功能、觸發(fā)CD4+T細(xì)胞的凋亡。
　　5.巨噬細(xì)胞感染鼠傷寒沙門氏菌后細(xì)胞因子和炎性小體及其下游信號(hào)分子的表達(dá)上調(diào)
　　對(duì)小鼠腹腔巨噬

10、細(xì)胞體外感染鼠傷寒沙門氏菌后各種指標(biāo)的檢測(cè)證明，巨噬細(xì)胞感染后IL-1β的分泌量增多，炎性小體NLRC4和NLRP3及caspase-1的表達(dá)量增加，并且自感染6小時(shí)即明顯增加，至18小時(shí)達(dá)到高峰，24小時(shí)略有下降。
　　6.α-乳糖阻斷galectin-9-Tim-3的結(jié)合影響巨噬細(xì)胞炎性小體NLRC4和NLRP3及caspase-1的表達(dá)
　　在巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞共孵育體系中加入不同濃度α-乳糖，檢測(cè)巨噬細(xì)胞中炎性

11、小體及其下游信號(hào)分子的表達(dá)。結(jié)果顯示，感染鼠傷寒沙門氏菌可以激活炎性小體的表達(dá);再加入CD4+T細(xì)胞共孵育，可進(jìn)一步提高炎性小體的表達(dá)水平;當(dāng)加入不同濃度的α-乳糖后，隨著乳糖濃度的升高炎性小體的表達(dá)呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)。說(shuō)明galectin-9-Tim-3的結(jié)合可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)炎性小體及其下游信號(hào)分子。
　　7.IL-1β促進(jìn)巨噬細(xì)胞的殺菌能力和galectin-9的表達(dá)
　　小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外感染鼠傷寒沙門氏菌后加入

12、不同濃度IL-1β刺激，觀察巨噬細(xì)胞載菌量的變化。發(fā)現(xiàn)隨著IL-1β濃度的增加，巨噬細(xì)胞的載菌量逐漸下降。感染的巨噬細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞共孵育，同時(shí)加入IL-1β中和抗體，發(fā)現(xiàn)中和抗體的加入明顯削弱了巨噬細(xì)胞清除細(xì)菌的能力。而加入10ng/mL的IL-1β培養(yǎng)后，F(xiàn)ACS檢測(cè)巨噬細(xì)胞表達(dá)galectin-9的變化。結(jié)果顯示，IL-1β可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞galectin-9的表達(dá)，而且培養(yǎng)18小時(shí)較12小時(shí)時(shí)增加更加明顯。
　　結(jié)論:

13、
　　1.小腸固有層F4/80+CD11c+巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞在腸道免疫系統(tǒng)清除胞內(nèi)菌的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　2.小腸固有層巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞在清除病原菌過(guò)程中存在相互作用。
　　3.Galectin-9-Tim-3信號(hào)通路參與了腸道巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞之間的相互作用。
　　4.Galectin-9-Tim-3信號(hào)通路可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞炎性小體的表達(dá)及IL-1β的成熟和分泌。
　　5.IL