C-EBPβ在脂肪細(xì)胞分化過程中對(duì)自噬的調(diào)控及SCO1在肥胖相關(guān)代謝性疾病中的機(jī)制研究.pdf

1、肥胖主要是因?yàn)閿z入食物超過消耗的能量，從而表現(xiàn)為脂肪組織增大。導(dǎo)致脂肪組織增大最直接的原因又分為脂肪細(xì)胞數(shù)目的增多和體積的增大，而脂肪細(xì)胞數(shù)目增多很大程度是由于脂肪細(xì)胞異常分化所導(dǎo)致。所以弄清脂肪細(xì)胞分化的分子機(jī)制，對(duì)于臨床預(yù)防和治療肥胖相關(guān)代謝性疾病有很重要的指導(dǎo)意義。
　　前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞的過程由一系列復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，C/EBPβ這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在此過程中扮演著重要角色。為了更深入了解C/EBPβ在脂肪細(xì)胞分化過程

2、中的作用機(jī)理，本課題運(yùn)用ChIP-on-chip技術(shù)篩選3T3-L1脂肪細(xì)胞分化早期受C/EBPβ調(diào)控的靶基因。結(jié)果篩選到一組自噬相關(guān)基因，Atg2a，Atg4b，Atg7，Atg9a，Atg10。用小干擾RNA將3T3-L1脂肪細(xì)胞中C/EBPβ敲低后，只有Atg4b的表達(dá)水平受到明顯抑制。進(jìn)一步用ChIP-qPCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示C/EBPβ能夠特異性結(jié)合到Atg4b的啟動(dòng)子區(qū)域上，且不能結(jié)合到其他幾個(gè)自噬基因的啟動(dòng)子上。同時(shí)，運(yùn)用點(diǎn)

3、突變或者截?cái)鄬?shí)驗(yàn)證明，C/EBPβ是通過結(jié)合在Atg4b的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游6143至6130的區(qū)域從而調(diào)控Atg4b的表達(dá)。以上結(jié)果表明:C/EBPβ通過結(jié)合到Atg4b這個(gè)靶基因的啟動(dòng)子特點(diǎn)區(qū)域上調(diào)控Atg4b的表達(dá)，從而調(diào)控脂肪細(xì)胞分化早期的自噬形成。
　　Atg4b作為一種半胱氨酸蛋白酶，能夠?qū)C3前體剪切生成LCI型，這個(gè)過程對(duì)于自噬泡的形成是必需的。我們運(yùn)用siRNA將3T3-L1細(xì)胞中的Atg4b敲低，導(dǎo)致細(xì)胞

4、內(nèi)自噬過程明顯被抑制，同時(shí)脂肪細(xì)胞的分化也明顯被抑制。進(jìn)一步采取敲低和挽救實(shí)驗(yàn)，利用鼠源siRNA將Atg4b敲低的同時(shí)，外轉(zhuǎn)人源Atg4b質(zhì)粒能夠挽救脂肪細(xì)胞的自噬和分化過程，且挽救程度與外轉(zhuǎn)Atg4b質(zhì)粒的數(shù)量成正比。以上實(shí)驗(yàn)說明:C/EBPβ激活A(yù)tg4b表達(dá)不僅在3T3-L1細(xì)胞脂肪自噬形成過程發(fā)揮重要作用，對(duì)于脂肪細(xì)胞的分化過程也是必須的。
　　自噬在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的第2-4天之間有一個(gè)十分顯著的增加，由于自噬通常降解

5、胞內(nèi)許多蛋白發(fā)揮其功能，我們猜測(cè)，自噬可能通過降解一些分化早期重要的抑制因子從而促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化。為了驗(yàn)證這個(gè)猜想，我們檢測(cè)了一系列抑制因子的降解過程，在加入自噬抑制劑3-MA后，3天收細(xì)胞檢測(cè)，只有Klf2及Klf3的降解被明顯抑制，其他抑制因子的降解均不受影響。加入泛素化途徑的抑制劑MG132，并不能抑制Klf2及Klf3的降解。進(jìn)一步應(yīng)用siRNA將Klf2及Klf3敲低，顯著挽救了加入3-MA或者siAtg4b對(duì)分化的抑制。以

6、上結(jié)果表明:Klf2及Klf3通過自噬途徑降解對(duì)于脂肪細(xì)胞的分化過程是必需的。
　　p62作為一種自噬降解特異性的底物，文獻(xiàn)報(bào)道其可招募多泛素化蛋白PML-視黃酸受體(RARa)到自噬泡降解，促進(jìn)骨髓細(xì)胞的分化。p62在脂肪細(xì)胞分化過程中是否也發(fā)揮同樣的作用？我們運(yùn)用ChIP實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，p62與Klf2及Klf3在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)后第3天存在相互作用，而0-2天并不存在這種相互作用。p62是一種多泛素化結(jié)合蛋白，我們檢測(cè)到Klf2及

7、Klf3泛素化水平也是在第3天左右最高，這與p62主要在第3天與Klf2及Klf3相結(jié)合是一致的。
　　p62與Klf2及Klf3結(jié)合后是否通過自噬途徑降解？我們采用免疫熒光檢測(cè)Klf2及Klf3與自噬泡的標(biāo)志蛋白LC3的共定位。研究發(fā)現(xiàn)，GFP標(biāo)記的外轉(zhuǎn)Klf2及Klf3與LC3的確存在共定位，在3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)4小時(shí)后敲低p62，這種共定位就不存在了，說明Klf2及Klf3與LC3的共定位是通過p62介導(dǎo)的。外轉(zhuǎn)人源的p6

8、2質(zhì)粒能夠挽救siRNA將內(nèi)源p62敲低后對(duì)Klf2與Klf3與LC3的共定位。如果將外轉(zhuǎn)人源p62的LC3結(jié)合區(qū)域突變，就不能挽救內(nèi)源p62敲低后對(duì)Klf2及Klf3與LC3的共定位缺失。以上結(jié)果說明:p62通過自噬途徑降解Klf2及Klf3從而促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化。
　　為了印證以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果在動(dòng)物水平同樣存在，我們用ChIP技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在C57BL/6J老鼠的白色脂肪組織中，C/EBPβ同樣結(jié)合到Atg4b的啟動(dòng)子上。重組腺病

9、毒表達(dá)的shAtg4b注射入老鼠的一側(cè)白色脂肪墊，另一側(cè)注射重組腺病毒表達(dá)的LacZ作為對(duì)照，取組織western blot驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，注射shAtg4b能夠抑制LC3的剪切和p62的降解，導(dǎo)致p62堆積，說明自噬過程受到明顯抑制。和細(xì)胞水平一樣，注射shAtg4b后，Klf2及Klf3的降解過程也明顯受到抑制，PPARγ及C/EBPa的表達(dá)明顯增加。同時(shí)，整個(gè)脂肪組織明顯變小。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)其脂肪組織里的脂肪細(xì)胞體積變小，表明脂肪細(xì)胞

10、里的脂滴減少了，同時(shí)脂肪組織中的脂肪細(xì)胞百分比也降低，說明脂肪細(xì)胞的分化過程受到了抑制。比較正常飲食喂養(yǎng)的C57BL/6J老鼠及用高脂飲食誘導(dǎo)的C57BL/6J肥胖老鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C/EBPβ，PPARr，C/EBPa，Atg4b及自噬水平均在肥胖老鼠脂肪組織高表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
　　綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)，C/EBPβ通過轉(zhuǎn)錄激活一個(gè)重要的自噬基因Atg4b，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化過程中的自噬。自噬激活后通過p

11、62介導(dǎo)方式特異性降解klf2及klf3，從而保證分化過程的按時(shí)正常進(jìn)行。同時(shí)，C/EBPβ通過轉(zhuǎn)錄激活PPARγ和C/EBPα，兩方面的協(xié)調(diào)效應(yīng)促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化。本課題的研究中獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為我們提供了一種關(guān)于C/EBPβ功能的新見解，揭示了其在脂肪細(xì)胞分化中自噬形成中的分子機(jī)理。人為介入這個(gè)過程或許能夠?yàn)橹委熞蛑窘M織的過度堆積導(dǎo)致的肥胖及相關(guān)代謝性疾病提供新的思路。
　　肥胖及相關(guān)的代謝性疾病諸如二型糖尿病，心血管疾病及癌

12、癥已經(jīng)成為人類健康的重大威脅。生活環(huán)境的改變無疑是推動(dòng)肥胖患病率上升的一大因素，然而我們更應(yīng)該關(guān)注在相同環(huán)境下不同遺傳背景所導(dǎo)致的個(gè)體體重的差異。所以很有必要采用遺傳手段研究涉及到體重調(diào)節(jié)和肥胖易感相關(guān)的基因。
　　在2004年中國(guó)上海市瑞金醫(yī)院內(nèi)分泌科做的基因芯片研究中，作者各取2例正常人及單純肥胖患者的大網(wǎng)膜脂肪組織做基因表達(dá)譜分析。2007年另一研究中，作者選取二型糖尿病患者作為研究對(duì)象，比較肥胖及非肥胖患者肝組織差異表達(dá)的

13、基因。在上述兩篇文章的研究中，其中有一個(gè)基因SCO1，在肥胖患者脂肪組織及肥胖患者肝臟組織中均較對(duì)照組高。以上結(jié)果提示SCO1與肥胖的發(fā)生有潛在的相關(guān)性。但是SCO1是否參與肥胖的發(fā)生，目前還不清楚。SCO1是鑲嵌在線粒體內(nèi)膜的一種金屬蛋白，參與銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)至兩個(gè)銅離子形成的CuA中心及細(xì)胞色素C氧化酶的亞基COX2生物合成的蛋白。作為參與銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)，SCO1能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的銅離子平衡。但是，SCO1調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)銅離子平衡的具體機(jī)制

14、仍然不清楚。在本課題中，我們分別比較3種肥胖老鼠模型，ob/obmice，db/db mice，HFD mice與正常體重老鼠的肝臟組織，皮下脂肪組織，內(nèi)臟脂肪組織中SCO1的表達(dá)情況。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不論是在mRNA水平還是在蛋白質(zhì)水平，SCO1在肥胖老鼠的肝臟組織及脂肪組織中均較正常體重老鼠的相應(yīng)組織中表達(dá)水平高，初步驗(yàn)證了上面兩篇文章的研究結(jié)果，提示SCO1與肥胖密切相關(guān)。同時(shí)，SCO1在肥胖老鼠的心臟組織和棕色脂肪組織的表達(dá)水平也

15、較正常體重老鼠的相應(yīng)組織中表達(dá)水平高。
　　目前關(guān)于SCO1的功能研究均與銅離子有關(guān)，而銅離子又是一種生命必須的微量元素，在調(diào)節(jié)代謝方面發(fā)揮重要作用。有文獻(xiàn)報(bào)道銅離子缺乏的病人表現(xiàn)為血清或者組織中膽固醇增高及其他一些脂代謝的相應(yīng)改變。而肥胖、2型糖尿病及一些心血管疾病中血清中膽固醇含量均是明顯增高。這些疾病是否與銅離子的缺乏有關(guān)，目前并不清楚。臨床流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，2型糖尿病病人的血銅和尿銅水平均較正常人要高。由于目前在人體的

16、研究基本只能檢測(cè)研究血液或者尿液中銅離子的水平，但是對(duì)組織中銅離子的含量暫時(shí)無法檢測(cè)，所以可能血液或者尿液中銅離子的高水平恰恰掩蓋了組織銅離子的缺乏。為了驗(yàn)證這種猜想，我們分別取正常老鼠及肥胖老鼠各個(gè)組織及血液尿液，運(yùn)用ICP-光譜分析各個(gè)組織，血液及尿液中銅離子含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在血液及尿液中，肥胖組中銅離子較正常體重組要高，這個(gè)與流行病學(xué)調(diào)查中2型糖尿病病人的結(jié)果是一致的，但是在皮下脂肪組織，內(nèi)臟脂肪組織，棕色脂肪組織，肝臟，心臟中，

17、肥胖組中銅離子含量均較正常體重中要明顯降低。以上結(jié)果驗(yàn)證了我們的猜想。進(jìn)一步，我們構(gòu)建了慢病毒載體表達(dá)的shRNA，注射入肥胖老鼠腹股溝脂肪墊，將局部皮下脂肪組織中SCO1敲低后，我們發(fā)現(xiàn)小鼠皮下脂肪組織的銅離子水平較對(duì)照組增高了28％左右，內(nèi)臟脂肪組織，肝臟，心臟中的銅離子水平均較對(duì)照組升高了1-1.5倍不等。而相應(yīng)的，血液和尿液中銅離子水平卻顯著下降，血液下降了3倍左右，尿液下降了2.5倍左右。上述結(jié)果提示，敲低SCO1可能導(dǎo)致機(jī)體

18、銅離子發(fā)生了重新分布，銅離子重新進(jìn)入了需要銅離子的器官中，而處于循環(huán)及排泄系統(tǒng)中的銅離子水平顯著降低。我們?cè)诩?xì)胞水平過表達(dá)SCO1，然后用ICP-光譜技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)銅離子的分布。研究結(jié)果顯示，當(dāng)SCO1過表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)的銅離子顯著減少，細(xì)胞培液中銅離子明顯增加。這說明SCO1的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致銅離子無法在細(xì)胞內(nèi)停留，跟組織水平中SCO1高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致整個(gè)組織水平銅離子相契合。同時(shí)，將肥胖皮下老鼠脂肪組織中SCO1敲低以后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血液中膽固醇含

19、量得到明顯改善，與文獻(xiàn)報(bào)道銅離子缺乏導(dǎo)致肝臟及血液中膽固醇增高相互印證。
　　體內(nèi)許多酶發(fā)揮功能均需要銅離子的參與，比如Cu-ATPase，血漿銅藍(lán)蛋白(CP)與Cu-Zn-SOD1等。其中，Cu-Zn-SOD1是機(jī)體抗氧化應(yīng)激很重要的酶，如果銅離子缺乏，會(huì)導(dǎo)致其抗氧化供能減弱，氧化應(yīng)激水平增加。而氧化應(yīng)激是促進(jìn)肥胖發(fā)生的重要因素。為了驗(yàn)證SCO1高表達(dá)是否會(huì)導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激水平增高，我們?cè)诩?xì)胞水平過表達(dá)SCO1，然后運(yùn)用試劑盒檢

20、測(cè)ROS水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SCO1組ROS水平較對(duì)照組ROS水平明顯增加。與之一致的是，肥胖老鼠中SCO1高表達(dá)的各種組織中，ROS水平也相應(yīng)的高表達(dá)。當(dāng)運(yùn)用慢病毒載體表達(dá)的shRNA注射入肥胖老鼠皮下脂肪墊敲低SCO1后，皮下脂肪組織本身的ROS水平一定程度的被改善（ROS降低27％），這一結(jié)果與皮下脂肪組織銅離子本身只增加了28％相契合。相應(yīng)的，銅離子水平明顯增高的組織（內(nèi)臟脂肪組織，肝臟，心臟），其ROS水平明顯的改善，同時(shí)皮下

21、脂肪組織的炎癥水平也得到了一定程度的改善（炎癥因子如MCP1，IL6，TNFa表達(dá)下降，抗炎因子IL10表達(dá)增加）。
　　組織中ROS水平的增加，可能是銅離子缺乏使SOD1的酶活性降低，導(dǎo)致清除ROS的能力降低所致。如上所述，當(dāng)運(yùn)用慢病毒載體表達(dá)的shRNA，注射入肥胖老鼠皮下脂肪墊敲低SCO1后，運(yùn)用試劑盒檢測(cè)各個(gè)組織中SOD1的酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)銅離子改善的各個(gè)組織中SOD1的酶活性均明顯增高。上述結(jié)果提示，SCO1敲低以后RO

22、S的改善，是因?yàn)榍宄齊OS能力得到了提升。
　　為了排除皮下脂肪組織注射shRNA敲低全身各個(gè)組織SCO1表達(dá)的局限性，我們采用腹腔注射的方式，敲低ob/ob及db/db老鼠全身相應(yīng)組織中SCO1的表達(dá)，在脂肪組織，肝臟及心臟中SCO1被敲低后，我們發(fā)現(xiàn)銅離子重新進(jìn)入各個(gè)組織，血液及尿液中銅離子含量減少，緩解組織中銅的缺乏，提高組織的抗氧化能力，同時(shí)減少血液中膽固醇含量。這些結(jié)果與采取腹股溝注射shRNA敲低SCO1后的結(jié)果基本一

23、致。
　　我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，在肥胖老鼠的脂肪組織及肝臟及心臟組織中，因?yàn)镾CO1的異常高表達(dá)，銅離子不能正常進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致身體中的銅離子滯留于血液或者進(jìn)入尿液中，無法進(jìn)入真正需要銅離子的各個(gè)組織。銅缺乏導(dǎo)致需要銅離子的超氧化物歧化酶功能受到明顯抑制，導(dǎo)致機(jī)體的ROS水平過多而引發(fā)炎癥。并且銅離子的缺乏會(huì)導(dǎo)致血液中膽固醇增加。通過上述方式，SCO1促進(jìn)了肥胖及相關(guān)代謝性疾病的發(fā)生。我們的研究工作揭示了SCO1在肥胖發(fā)生過程中的重