靶向ICP4的RNA干擾對(duì)HSV-1病毒復(fù)制能力影響.pdf

1、單純皰疹病毒1型(HSV-1)為雙鏈包膜DNA病毒,具有親神經(jīng)的特性,在人群中感染廣泛。HSV-1感染外周神經(jīng)后可逆行跨越神經(jīng)元進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)并建立潛伏感染,病毒裂解后引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p傷。HSV-1基因組表達(dá)有很高時(shí)序性,分即早基因(IE),早期基因(E)和晚期基因(L)。作為IE基因產(chǎn)物之一的即早蛋白ICP4可刺激E基因表達(dá)和DNA合成,誘導(dǎo)L基因的表達(dá),是HSV-1基因表達(dá)從而引發(fā)感染的關(guān)鍵激活因子。因此,有效抑制ICP4的

2、表達(dá)可以通過阻止HSV-1的復(fù)制達(dá)到治療HSV-1感染性疾病的目的。RNA干擾(RNAi)是一種細(xì)胞本身固有的對(duì)抗外源基因侵犯的自我保護(hù)現(xiàn)象,雙鏈RNA(dsRNA)分子在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列及基因的表達(dá)使其沉默。在此基礎(chǔ)上建立的RNAi技術(shù)不僅僅是一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段,更為研究者在基因功能測(cè)定和基因治療等方面開辟了新思路。
　　 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建表達(dá)ICP4 siRNA(小干擾RNA)的重組真核慢病毒質(zhì)粒

3、PLKO.1-puro-ICP4-siRNA,將產(chǎn)生的重組病毒顆粒感染Vero細(xì)胞,建立穩(wěn)定表達(dá)ICP4 siRNA的重組Vero-ICP4-siRNA細(xì)胞系；進(jìn)一步探討干擾HSV-1 ICP4基因后對(duì)HSV-1復(fù)制能力的影響,為臨床上運(yùn)用RNAi治療HSV-1感染性疾病提供思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的:
　　 1建立穩(wěn)定表達(dá)ICP4特異性siRNA的重組細(xì)胞系。
　　 2初步分析靶向ICP4的siRNA對(duì)HSV

4、-1在Vero細(xì)胞中復(fù)制能力的影響。
　　 方法：
　　 1基因工程技術(shù)構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒PLKO.1-puro-ICP4-siRNA,雙酶切及測(cè)序鑒定。
　　 2三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生重組慢病毒顆粒。
　　 3重組病毒顆粒感染Vero細(xì)胞,嘌呤霉素篩選法建立ICP4-siRNA表達(dá)陽性的重組細(xì)胞系。
　　 4采用Realtimc PCR和Western blot鑒定重組Vcro-ICP4-

5、siRNA細(xì)胞系。
　　 5通過觀察HSV感染重組Vero細(xì)胞后CPE(細(xì)胞病變效應(yīng))表達(dá)和TCID50(半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量)法測(cè)定HSV-1滴度,檢測(cè)靶向ICP4的siRNAs對(duì)HSV-1病毒復(fù)制能力的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1成功構(gòu)建重組真核慢病毒質(zhì)粒PLKO.1-puro-ICP4-siRNA。
　　 2獲得有效濃度的穩(wěn)定表達(dá)ICP4的siRNAs的重組慢病毒顆粒。
　　 3成功建立穩(wěn)

6、定表達(dá)ICP4特異性siRNA的重組細(xì)胞系。
　　 4在mRNA和蛋白水平證實(shí)重組Vero-ICP4-siRNA細(xì)胞中的HSV-1 ICP4表達(dá)被抑制。
　　 5感染野生型HSV-1后,siRNA組Vero細(xì)胞的CPE表達(dá)率與陰性對(duì)照組比較有明顯降低。進(jìn)一步采用TCID50法測(cè)定病毒滴度并對(duì)TCID值進(jìn)行AVONA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn),siRNA組HSV滴度與對(duì)照組存在顯著差異(P<0.001),siRNA組低于對(duì)照組；且針對(duì)