庚型肝炎病毒作為復制型基因治療載體及小干擾RNA對病毒表達復制抑制作用的研究.pdf

1、第一部分,HGV作為復制型基因治療載體的實驗研究.庚型肝炎病毒(hepatitis G virus,HGV)是單正鏈的RNA病毒,長約9.4Kb,含一個開放讀碼框架,編碼2900左右的氨基酸.病毒具有細胞親嗜性,分別存在著淋巴細胞和肝細胞親嗜株,該室建立的HGV克隆株經初步實驗證實其可能是肝細胞親嗜性的.HGV與HCV同屬于黃病毒家族,其基因組結構和復制機理也非常相似.用外源基因neo代替HCV的結構基因區(qū),并插入ECMVIRES直接翻

2、譯HCV的非結構基因區(qū),由此建立的HCV亞基因組復制子能夠在體外培養(yǎng)細胞中自主持久復制和表達.因此,我們嘗試將HGV基因組進行適當改造,用外源報告基因或治療基因代替HGV的結構基因,并插入篩選標志抗性基因neo,兩者間直接用ECMVIRES連接,保留HGV的非結構基因,由此建立HGV亞基因組復制子,研究其在穩(wěn)定表達HGV結構蛋白的體外培養(yǎng)細胞中的復制、表達和病毒的包裝,探索將病毒構建成能自主復制并且具有肝組織靶向性的一類新型載體,以期用

3、于肝病的基因治療.第二部分,小干擾RNA對庚型肝炎病毒表達復制抑制作用的研究.RNA干擾(RNAi)是由小干擾RNA(siRNA)引發(fā)的生物細胞內同源基因的轉錄后基因沉默現象,是近年來興起的一項研究生物基因調控與功能的嶄新技術,是機體抵御外在感染的一種重要保護機制,是一種簡單、有效的代替基因敲除的遺傳工具.其本質是siRNA與其對應的靶mRNA特異結合,降解靶RNA從而阻止其轉錄后的翻譯.siRNA是雙鏈RNA(double-stran

4、d RNA,dsRNA)被RNase Ⅲ家族中的核酸酶Dicer降解后產生的長21-23個核苷酸(nucleotide,nt)的小片段,具有5′-磷酸、3′-羥基和1-2nt的3′-粘性末端.該課題設計了靶向HGV E2區(qū)的兩對siRNA,研究siRNA對HGV病毒RNA合成和基因表達的抑制作用,探討RNAi在阻斷病毒復制方面的應用.實驗還同時設計了靶向報告基因EGFP的一個已知有效的siRNA作為陽性對照,設計一個與人、小鼠、大鼠等基

5、因無任何同源性的無關siRNA作為陰性對照.綜上所述,該研究中采用全長HGV結構基因包括5′NTR區(qū)構建了表達載體,轉染Huh7細胞證實其能成功表達和剪切、修飾,提示建立的HuhEH細胞株可能可以作為HGV基因治療載體的包裝細胞.構建了同時帶有報告基因與篩選基因或是治療基因與篩選基因的HGV亞基因組復制子,并在體外培養(yǎng)細胞Huh7中證實此復制子是能夠自主持久表達和復制的,并在培養(yǎng)上清中檢測到了HGV復制子RNA的存在,電鏡下檢測到了可疑