ICP27特異性siRNA抑制HSV-1病毒復(fù)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、單純皰疹病毒性腦炎(Herpes simplex virus encephalitis,HSE)是散發(fā)性病毒性腦炎中最常見(jiàn)的類型,其病情嚴(yán)重、發(fā)展迅速、病死率高。現(xiàn)有的抗HSV-1藥物不能完全抑制和清除潛伏的病毒,且耐藥性強(qiáng)。95％的成人HSE由單純皰疹病毒1型(Herpes simplex virus type1,HSV-1)引起,HSV-1是雙鏈的包膜DNA病毒,按照基因表達(dá)的時(shí)序性,基因組可分為立即早期基因(immediate-e

2、arly,IE)、早期基因(early,E)和晚期基因(late,L)。ICP27(infected cellprotein,感染細(xì)胞蛋白)為63 KDa的感染細(xì)胞蛋白,是HSV-1病毒復(fù)制必需的關(guān)鍵激活子,在HSV-1生命周期的IE期產(chǎn)生。ICP27抑制宿主細(xì)胞mRNA剪接,補(bǔ)充病毒復(fù)制位點(diǎn)的RNAⅡ聚合酶,促進(jìn)病毒轉(zhuǎn)錄體核輸出；抑制IE、E基因,活化L基因,促使E基因想L基因表達(dá),刺激病毒轉(zhuǎn)錄翻譯；同時(shí)與抑制Ⅰ型干擾素信號(hào)和HSV-

3、1病毒體的合成相關(guān)。
　　 RNA干擾是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默過(guò)程,其作為一種新型基因阻斷技術(shù)與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)以及反義技術(shù)相比,具有特異性強(qiáng)、效能高、作用迅速、毒性低、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于感染性病毒的基因治療研究,并取得了令人鼓舞的效果。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立穩(wěn)定表達(dá)ICP27序列特異性siRNA的重組Vero-siRNA細(xì)胞系,初步分析抑制ICP27對(duì)HSV-1在Vero細(xì)胞中復(fù)制能力的影響,探索

4、ICP27缺失是否具有阻斷HSV-1復(fù)制的可能,從而為確定ICP27基因作為HSV-1的抗病毒藥物靶點(diǎn)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 目的:
　　 1建立穩(wěn)定表達(dá)ICP27序列特異性siRNA的重組Vero-siRNA細(xì)胞系。
　　 2初步分析ICP27序列特異性siRNA對(duì)HSV-1體外復(fù)制的抑制作用。
　　 方法：
　　 1以HSV-1 ICP27基因?yàn)榘悬c(diǎn),設(shè)計(jì)3對(duì)特異性siRNA,退火連接到慢病毒質(zhì)

5、粒pLKO.1-puro,構(gòu)建重組pLKO.1-puro-siRNA慢病毒表達(dá)載體,利用MluⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定。
　　 2利用脂質(zhì)體2000將pLKO.1-puro-siRNA、△8.2、VSV-G三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞得到重組慢病毒。
　　 3重組慢病毒感染Vero細(xì)胞,經(jīng)Puromycin加壓篩選,有限稀釋后挑取單個(gè)細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng),即得到重組Vero-siRNA細(xì)胞系。
　　 4野生型HSV-1病

6、毒感染重組細(xì)胞,利用Realtime PCR和Western blot分別檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ICP27 mRNA和蛋白表達(dá)情況。
　　 5用MOI=0.1的野生型HSV-1病毒感染各組細(xì)胞,24 h后觀察各組細(xì)胞病變效應(yīng)情況,并收集細(xì)胞和上清,利用TCID法測(cè)定各組病毒滴度。
　　 6采用單因素方差分析(One-way analysis of variance,ANOVA),以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

7、r>　　 結(jié)果：
　　 1 SiRNA退火連接到慢病毒質(zhì)粒pLKO.1-puro,篩選陽(yáng)性菌落,經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序顯示pLKO.1-puro-siRNA構(gòu)建成功。
　　 2嘌呤霉素加壓篩選和有限稀釋后成功篩選出ICP27序列特異性siRNA表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞克隆。
　　 3感染HSV-1后,Realtime PCR結(jié)果顯示重組Vero-siRNA組細(xì)胞內(nèi)ICP27mRNA表達(dá)的抑制效率均達(dá)85％以上(P<0.001)

8、,Western blot證實(shí)ICP27蛋白表達(dá)也較對(duì)照組明顯減弱。重組Vero-siRNA細(xì)胞系建立成功。
　　 4接種HSV-1后,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中細(xì)胞病變效應(yīng)較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組少40％以上；TCID50結(jié)果顯示,Veto-siRNA組的病毒滴度比對(duì)照組降低約1～2 log10(P<0.001),ICP27序列特異性siRNA對(duì)HSV-1病毒復(fù)制的抑制率均到達(dá)80％以上,其中siRNA2抑制效率最高,約為97％。