纈沙坦抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞增殖和遷移及其相關(guān)機制.pdf

1、目的:觀察纈沙坦（valsartan）對血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）增殖、遷移的影響，并探討其相關(guān)機制。
　　方法:
　　1．細胞培養(yǎng)：以大鼠胸主動脈平滑肌細胞株（A7r5）為研究對象，用含10％優(yōu)質(zhì)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中，2-3天換液一次，待細胞生長至約90

2、%融合時對其進行1:2傳代處理。實驗所用細胞，均為狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞。
　　2．免疫熒光法檢測細胞內(nèi)活性氧的含量：將細胞分為七組：①對照（DMSO）組、②血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）1μM組、③纈沙坦（valsartan,Val）10μM組、④血管緊張素Ⅱ1μM+纈沙坦10μM組、⑤血管緊張素Ⅱ1μM+ N-乙酰半胱氨酸（NAC,抗氧化劑）1mM組、⑥血管緊張素Ⅱ1μM+纈沙坦10μM+復(fù)合物C（Com

3、poud C,CompC,AMPK抑制劑）1μM組、⑦血管緊張素Ⅱ1μM+5-氨基咪哇-4-甲酞胺核糖核普酸（5-Aminoimidazole-4earboxamide-ribo-nucle-oside,AICAR,AMPK激活劑）100μM組。取對數(shù)生長期細胞，各組細胞予以相應(yīng)藥物處理24h后檢測細胞內(nèi)活性氧含量。
　　3．CCK8法檢測細胞的增殖能力：將細胞進行分組，分組情況同活性氧檢測。相應(yīng)藥物分別處理細胞0h、24h、48

4、h、72h、96h后，檢測各組細胞的增殖情況。
　　4．劃痕實驗檢測細胞的遷移能力：將細胞進行分組，分組情況同活性氧檢測。細胞鋪板12h，待完全貼壁后，予以含0.5%血清的培養(yǎng)基饑餓24h，然后對其進行劃痕，并予以含相應(yīng)藥物的低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，藥物處理48h后檢測各組細胞遷移情況。
　　5．Western-blot檢測細胞內(nèi)AMPK、Akt、mTOR磷酸化和總蛋白水平：分別用血管緊張素Ⅱ(1μM)和纈沙坦處(10μM)理細胞

5、0h、30min、1h、3h、6h、12h、24h，觀察各個時間點兩組細胞內(nèi)AMPK、Akt、mTOR磷酸化和總蛋白水平；將細胞分為五組：①對照（DMSO）組、②血管緊張素Ⅱ1μM組、③纈沙坦10μM組、④血管緊張素Ⅱ1μM+纈沙坦10μM組、⑤血管緊張素Ⅱ1μM+N-乙酰半胱氨酸1mM，分別在1h、6h兩個時間點檢測各組細胞內(nèi)AMPK、Akt磷酸化和總蛋白水平；將細胞進行分組（同活性氧檢測），相應(yīng)藥物處理6h后檢測各組細胞內(nèi)mTOR磷

6、酸化和總蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　1．血管緊張素Ⅱ促進血管平滑肌細胞內(nèi)活性氧的生成，纈沙坦、NAC、AICAR抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的活性氧的生成，Compound C減弱纈沙坦抑制血管平滑肌細胞生成活性氧的能力。
　　2．血管緊張素Ⅱ促進血管平滑肌細胞增殖，纈沙坦、NAC、AICAR抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的細胞增殖，Compound C減弱纈沙坦抑制血管平滑肌細胞增殖的能力。
　　3．血管緊張素Ⅱ促進血管平滑肌細

7、胞遷移，纈沙坦、NAC、AICAR抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的細胞遷移，Compound C減弱纈沙坦抑制血管平滑肌細胞遷移的能力。
　　4．血管緊張素Ⅱ增加血管平滑肌細胞內(nèi)AMPK、Akt、mTOR的磷酸化水平；纈沙坦增加血管平滑肌細胞內(nèi)AMPK、Akt的磷酸化水平；纈沙坦、NAC抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的AMPK、Akt、mTOR磷酸化水平增加；Compound C減弱纈沙坦抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的mTOR磷酸化水平增加。
　　結(jié)論