乙醇-烏頭堿聯(lián)合染毒對心肌細胞鈣穩(wěn)態(tài)及RyR2-ser2808磷酸化影響的研究.pdf

1、在我國烏頭、附子及雪上一支蒿等76種烏頭屬植物被中醫(yī)學一直沿用至今。烏頭堿是烏頭屬植物中的主要有效成分，在強心、治療風濕、緩解疼痛、抗腫瘤及免疫抑制等方面具有醫(yī)用價值。但是烏頭堿也具有心臟毒性及神經(jīng)毒性，它可以引起中樞神經(jīng)和呼吸中樞抑制，同時引起多種心律失常，如室性心動過速、房室傳導阻滯及室性纖顫等。而惡性心律失常是烏頭堿中毒者最終死亡的主要原因。在民間用烏頭屬植物浸泡藥酒進行止痛、強身的習慣，但是每年都有因飲用烏頭藥酒中毒甚至死亡的案

2、件發(fā)生。雖然少數(shù)研究從毒物代謝學角度提出乙醇能增加烏頭堿等有毒成分的溶解度，促進其吸收，但未有研究探索兩者對心臟產(chǎn)生的毒性效應的相互關系及具體作用機制。研究顯示電壓門控鈣離子通道包括雷諾定受體(Ryanodine receptor2，RyR2)易被烏頭堿及乙醇影響而發(fā)生改變。鈣穩(wěn)態(tài)破壞及RyR2-ser2808被過度磷酸化會引起心律失常及心力衰竭。目前尚未有關于乙醇-烏頭堿聯(lián)合染毒對心肌細胞鈣穩(wěn)態(tài)及RyR2-ser2808蛋白磷酸化影響

3、的相關研究報道。
　　目的：
　　研究乙醇-烏頭堿聯(lián)合染毒對心肌細胞鈣穩(wěn)態(tài)及RyR2-ser2808磷酸化影響相關性問題。為進一步探索乙醇和烏頭堿毒性效應的相互關系及具體作用機制指明道路，為臨床醫(yī)學及藥學制作有效解毒劑提供理論基礎，為法醫(yī)學獲取更便捷的檢測手段提供可能性。
　　方法：
　　選取來自動物中心的1-3天SPF級大鼠的乳鼠，按照無菌操作要求剪取心臟，心室肌組織采用由胰酶、膠原酶、及牛血清蛋白組成的消化液

4、進行消化，懸浮細胞采用差速貼壁法及5-溴脫氧尿嘧啶（5-Bromo-2-Deoxyuridine，5-Brdu）抑制成纖維細胞法進行純化，采用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-6天完成原代心肌細胞培養(yǎng)。心室肌細胞分成5組并進行染毒。對照組為無血清培養(yǎng)基組（A組），烏頭組為1.0μmol/L烏頭堿染毒組（B組），烏頭堿+乙醇組為1.0μmol/L烏頭堿及乙醇聯(lián)合染毒組（C組），其中C組分C1、C2及C3共三組，即1.0μmol/L烏頭堿+5mmol/L

5、乙醇染毒組（C1組），1.0μmol/L烏頭堿+50mmol/L乙醇染毒組（C2組），1.0μmol/L烏頭堿+100mmol/L乙醇染毒組（C3組）。急性染毒心室肌細胞培養(yǎng)的時間為1小時。后各組分別進行Western Blot檢測和激光共聚焦顯微鏡的觀察。Western Blot檢測RyR2-ser2808磷酸化蛋白及PKA蛋白的表達情況。5組心室肌細胞進行Fluo-4探針標記后通過激光共聚焦顯微鏡檢測從而觀察鈣穩(wěn)態(tài)的情況。
　

6、　結(jié)果：
　　采用本方法可以得到較高純度并滿足相關實驗要求的心室肌細胞。使用 CCK-8檢測試劑盒檢測細胞活性，通過與對照組對比，顯示1μM的烏頭堿可以降低其活性。除加入1μM烏頭堿外，同時加入乙醇的干預后，顯示其活性與乙醇的濃度有關。通過激光共聚焦檢測，除對照組外其余組的未出現(xiàn)典型鈣火花現(xiàn)象，鈣振蕩振幅減小，鈣穩(wěn)態(tài)破壞。1μM的烏頭堿染毒組（B組）與對照組相比，其心室肌細胞的PKA蛋白表達量升高。與1μM的烏頭堿染毒組對比，中及

7、高濃度的乙醇及烏頭堿聯(lián)合染毒可以使PKA蛋白表達量升高，但低濃度的乙醇無統(tǒng)計學意義。1μM的烏頭堿可以使RyR2-Ser2808磷酸化蛋白表達量升高。與1μM的烏頭堿染毒組對比，中及高濃度的乙醇與1μM烏頭堿聯(lián)合染毒RyR2-Ser2808蛋白磷酸化表達量顯著升高。
　　結(jié)論：
　　1μM烏頭堿可以通過影響鈣振蕩破壞鈣平衡。溶于中、高濃度的乙醇的烏頭堿可以進一步破壞鈣振蕩及鈣穩(wěn)態(tài)。同時烏頭堿及溶于中、高濃度的乙醇的烏頭堿影響

8、RyR2-Ser2808蛋白磷酸化水平（升高）及PKA的蛋白表達上調(diào)。PKA蛋白結(jié)果與RyR2-Ser2808蛋白磷酸化水平結(jié)果相互印證，支持PKA介導RyR2-Ser2808蛋白磷酸化的觀點。烏頭堿及中、高濃度的乙醇都具有心臟毒性，能降低心肌細胞活力。溶于中、高濃度乙醇的烏頭堿其可通過影響RyR2-Ser2808蛋白磷酸化水平途徑，破壞鈣穩(wěn)態(tài)，產(chǎn)生各種惡性心律失常。該途徑可能是烏頭堿與乙醇聯(lián)合作用于心臟的毒理學機制之一，其引起心率失常