IGF-1R調(diào)控乳腺癌增殖和遷移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：應(yīng)用短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞胰島素樣生長(zhǎng)因子1型受體（type I insulin-like growth factor receptor，IGF-1R）的表達(dá)，探討IGF-1R在乳腺癌細(xì)胞體外增殖、遷移及在乳腺癌移植瘤生長(zhǎng)中所起的作用，并探討IGF-1R調(diào)控乳腺癌增殖和遷移的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 方法：構(gòu)建攜帶有綠色熒光蛋白報(bào)告基因的IGF-1R s

2、hRNA質(zhì)粒載體，高效轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR和Western blot技術(shù)分別檢測(cè)IGF-1R mRNA和蛋白表達(dá)水平，篩選沉默效率最高的shRNA表達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)脂質(zhì)體法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，體外遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。通過(guò)G418篩選IGF-1R基因沉默的細(xì)胞穩(wěn)株，接種于重癥聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodefi

3、ciency ，SCID）小鼠乳腺脂肪墊成瘤，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，定期觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。使用小分子抑制物L(fēng)Y294002和PD98059分別抑制磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）通路和有絲分裂活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并給予胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin-like growth factor-1，IG

4、F-1）刺激，檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞體外增殖和遷移能力的變化。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建IGF-1R shRNA質(zhì)粒載體，并篩選出沉默效率最高的shRNA表達(dá)質(zhì)粒。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，IGF-1R mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞的效率約為60％。使用G418篩選和有限稀釋法獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，其體外增殖和遷移能力受到顯著抑制（p<0.01）。成功構(gòu)建SCID小鼠乳腺癌移植瘤模型，IGF-1R基因沉默組的

5、腫瘤生長(zhǎng)明顯減慢，移植瘤的體積明顯小于對(duì)照組（p<0.01）。IGF-1干預(yù)后MDA-MB-231細(xì)胞增殖和遷移能力明顯增強(qiáng)（p<0.05），LY294002和PD98059對(duì)IGF-1干預(yù)下的細(xì)胞增殖和遷移均有顯著抑制作用（p<0.01）。
　　 結(jié)論：IGF-1R shRNA表達(dá)質(zhì)粒能夠顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞IGF-1R的表達(dá)，顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的體外增殖和遷移能力。IGF-1R基因沉默的乳腺癌細(xì)胞在SCID小鼠內(nèi)