基于黃瓜花葉病毒的病毒誘導基因沉默載體構建.pdf

1、病毒誘導的基因沉默(virus-induee.gen.sileneing，VIGS)是近年來發(fā)展出的一種研究植物基因組功能的強有力的研究工具。病毒載體通過攜帶一段植物同源功能基因cDNA，侵染植物后誘導植物內源功能基因發(fā)生沉默，從而在植物的表型突變或生理指標上反映該基因的功能。黃瓜花葉病毒(Cucumbe.Mosai.Vrus，CMV)是典型的三分體單鏈正義RNA病毒。基于該病毒具有寄主范圍廣、復制水平高、基因組簡單等優(yōu)點，本研究試圖從

2、外源基因插入的位點及其插入片段的長度兩個方面分析CMV作為VIGS載體的分子特性。
　　 CM.2b蛋白是最早被證實的轉錄后基因沉默抑制子之一。2b基因的缺失或不表達使得CMV的致病性顯著降低，但并不影響突變體在煙草等寄主上的系統移動。為此，本論文首先將Fny-CMV的2b基因序列替換為本生煙八氫番茄紅素脫氫酶(phytoen.desaturase，PDS)基因片段，構建重組病毒Fny-CMVA2b-PDS353。該重組病毒在侵

3、染本生煙后5-7天，寄主頂端新葉開始出現光漂白表型，在接種后第14天，光漂白程度最為顯著。這說明該重組病毒確實誘導寄主PDS的沉默，這就是典型的VIGS現象。測序結果表明該重組病毒能夠穩(wěn)定遺傳。為了分析外源基因的不同插入位點對沉默效率的影響，我們在RNA第2564至2571位置插入該353b.PDS片段，構建了重組病毒Friy-CMV2546-PDS353。Fny-CMV2546-PDS353侵染本生煙后，本生煙葉片出現與Fny-CMV

4、△2b-PDS353相似的光漂白現象，其光漂白程度也基本相近。但是，該重組病毒轉接至第4代后，Frry-CMV2546-PDS353所引發(fā)的光漂白現象明顯弱于Fny-CMV△2b-PDS353。經穩(wěn)定性分析后發(fā)現重組病毒中說插入的353b.PDS序列在其中部發(fā)生171bp堿基的缺失，這很可能是光漂白現象減弱的根本原因?；诜€(wěn)定性和光漂白效果的比較結果，我們選擇Frry-CMV2546-PDS353作為骨架用于后續(xù)不同PDS片段長度的研究

5、。
　　 為了分析外源插入片段的長度與病毒誘導基因沉默效率的關系，我們選取1030bp、750bp、519bp、219bp、104bp長度的PDS基因cDNA片段，替換Fny-CMV△2b-PDS353病毒中353bp大小的PDS序列，構建產生重組體Fny-CMV△2b-PDS1030、Fny-CMV△2b-PDS750、Fny-CMVA2b-PDS518、Fny-CMV△2b-PDS219、Fny-CMV△2b-PDS104。

6、我們發(fā)現Fny-CMV△2b-PDS104只引起很弱的光漂白表型，而且漂白位點稀少。Fny-CMV△2b-PDS219引起較弱的光漂白，漂白位點零散和不均勻。Fny-CMV△2b-PDS1030、Fny-CMV△2b-PDS750、Fny-CMV△2b-PDS518與Fny-CMV△2b-PDS353在病毒侵染中期，均導致本生煙出現明顯的光漂白現象。其中，Fny-CMV△2b-PDS518所引起的光漂白現象最為強烈。以上5個重組病毒轉接

7、2代后，測序結果顯示：Fny-CMV△2b-PDS518、Fny-CMV△2b-PDS219和Fny-CMV△2b-PDS104均能穩(wěn)定遺傳；然而，Fny-CMV△2b-PDS1030和Fny-CMV△2b-PDS750二者出現嚴重的PDS片段缺失。這說明外源插入片段在750bp以上不能穩(wěn)定遺傳，很可能影響重組基因組的包被和長距離運輸。
　　 最后通過Northen雜交分析系統葉的病毒積累量、PD.mRNA積累量。發(fā)現基因沉默效