基于黃瓜花葉病毒的病毒誘導(dǎo)基因沉默載體構(gòu)建.pdf

1、病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-induee.gen.sileneing，VIGS)是近年來發(fā)展出的一種研究植物基因組功能的強(qiáng)有力的研究工具。病毒載體通過攜帶一段植物同源功能基因cDNA，侵染植物后誘導(dǎo)植物內(nèi)源功能基因發(fā)生沉默，從而在植物的表型突變或生理指標(biāo)上反映該基因的功能。黃瓜花葉病毒(Cucumbe.Mosai.Vrus，CMV)是典型的三分體單鏈正義RNA病毒?；谠摬《揪哂屑闹鞣秶鷱V、復(fù)制水平高、基因組簡單等優(yōu)點(diǎn)，本研究試圖從

2、外源基因插入的位點(diǎn)及其插入片段的長度兩個(gè)方面分析CMV作為VIGS載體的分子特性。
　　 CM.2b蛋白是最早被證實(shí)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默抑制子之一。2b基因的缺失或不表達(dá)使得CMV的致病性顯著降低，但并不影響突變體在煙草等寄主上的系統(tǒng)移動(dòng)。為此，本論文首先將Fny-CMV的2b基因序列替換為本生煙八氫番茄紅素脫氫酶(phytoen.desaturase，PDS)基因片段，構(gòu)建重組病毒Fny-CMVA2b-PDS353。該重組病毒在侵

3、染本生煙后5-7天，寄主頂端新葉開始出現(xiàn)光漂白表型，在接種后第14天，光漂白程度最為顯著。這說明該重組病毒確實(shí)誘導(dǎo)寄主PDS的沉默，這就是典型的VIGS現(xiàn)象。測(cè)序結(jié)果表明該重組病毒能夠穩(wěn)定遺傳。為了分析外源基因的不同插入位點(diǎn)對(duì)沉默效率的影響，我們?cè)赗NA第2564至2571位置插入該353b.PDS片段，構(gòu)建了重組病毒Friy-CMV2546-PDS353。Fny-CMV2546-PDS353侵染本生煙后，本生煙葉片出現(xiàn)與Fny-CMV

4、△2b-PDS353相似的光漂白現(xiàn)象，其光漂白程度也基本相近。但是，該重組病毒轉(zhuǎn)接至第4代后，F(xiàn)rry-CMV2546-PDS353所引發(fā)的光漂白現(xiàn)象明顯弱于Fny-CMV△2b-PDS353。經(jīng)穩(wěn)定性分析后發(fā)現(xiàn)重組病毒中說插入的353b.PDS序列在其中部發(fā)生171bp堿基的缺失，這很可能是光漂白現(xiàn)象減弱的根本原因?；诜€(wěn)定性和光漂白效果的比較結(jié)果，我們選擇Frry-CMV2546-PDS353作為骨架用于后續(xù)不同PDS片段長度的研究

5、。
　　 為了分析外源插入片段的長度與病毒誘導(dǎo)基因沉默效率的關(guān)系，我們選取1030bp、750bp、519bp、219bp、104bp長度的PDS基因cDNA片段，替換Fny-CMV△2b-PDS353病毒中353bp大小的PDS序列，構(gòu)建產(chǎn)生重組體Fny-CMV△2b-PDS1030、Fny-CMV△2b-PDS750、Fny-CMVA2b-PDS518、Fny-CMV△2b-PDS219、Fny-CMV△2b-PDS104。

6、我們發(fā)現(xiàn)Fny-CMV△2b-PDS104只引起很弱的光漂白表型，而且漂白位點(diǎn)稀少。Fny-CMV△2b-PDS219引起較弱的光漂白，漂白位點(diǎn)零散和不均勻。Fny-CMV△2b-PDS1030、Fny-CMV△2b-PDS750、Fny-CMV△2b-PDS518與Fny-CMV△2b-PDS353在病毒侵染中期，均導(dǎo)致本生煙出現(xiàn)明顯的光漂白現(xiàn)象。其中，F(xiàn)ny-CMV△2b-PDS518所引起的光漂白現(xiàn)象最為強(qiáng)烈。以上5個(gè)重組病毒轉(zhuǎn)接

7、2代后，測(cè)序結(jié)果顯示：Fny-CMV△2b-PDS518、Fny-CMV△2b-PDS219和Fny-CMV△2b-PDS104均能穩(wěn)定遺傳；然而，F(xiàn)ny-CMV△2b-PDS1030和Fny-CMV△2b-PDS750二者出現(xiàn)嚴(yán)重的PDS片段缺失。這說明外源插入片段在750bp以上不能穩(wěn)定遺傳，很可能影響重組基因組的包被和長距離運(yùn)輸。
　　 最后通過Northen雜交分析系統(tǒng)葉的病毒積累量、PD.mRNA積累量。發(fā)現(xiàn)基因沉默效