電刺激調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞活性促進(jìn)光損傷感光細(xì)胞存活的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分：電刺激促進(jìn)光損傷感光細(xì)胞存活的神經(jīng)保護(hù)作用
　　 體外培養(yǎng)感光細(xì)胞系(661W)，接種于六孔板貼壁后，放入光照培養(yǎng)箱中接受4～6 h光照強(qiáng)度為15，000 lux的寬譜藍(lán)光照射。在光照后的24 h進(jìn)行LDH細(xì)胞壞死測(cè)定實(shí)驗(yàn)、TUNEL凋亡染色及免疫熒光染色觀察661W的凋亡情況以及形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果顯示：光照后，LDH實(shí)驗(yàn)顯示59.7％±2.7％的661W細(xì)胞壞死，TUNEL顯示70％左右的染色陽(yáng)性即凋亡，而免疫熒光染色

2、則發(fā)現(xiàn)正常661W呈扁平狀，細(xì)胞之間連接緊密，但光損傷后661W突觸變細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞失去扁平形態(tài)，且細(xì)胞間隙明顯變大，表明光損傷誘導(dǎo)感光細(xì)胞凋亡模型成功建立。
　　 利用1 h雙相方波、直流電刺激(3 ms，20 Hz，300～1600μ A)預(yù)先作用于光損傷661W和小膠質(zhì)細(xì)胞或Müller細(xì)胞共培養(yǎng)體系，并將其視為干預(yù)組；將未接受電刺激的此共培養(yǎng)體系視為未干預(yù)對(duì)照組；正常661W細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞或Müller細(xì)胞共培養(yǎng)體系視為正

3、常對(duì)照組。在共培養(yǎng)后3 h、6 h、12 h、24 h進(jìn)行LDH實(shí)驗(yàn)，并在共培養(yǎng)后24 h進(jìn)行TUNEL凋亡染色實(shí)驗(yàn)及免疫熒光染色。結(jié)果如下：LDH凋亡一時(shí)間曲線表明1000μA的電刺激預(yù)先作用于光損傷661W和小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組之后，相較于未干預(yù)組相對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞死亡率，從共培養(yǎng)后12 h開(kāi)始661W的細(xì)胞死亡率顯著降低，并保持相對(duì)恒定直到共培養(yǎng)后24 h；同樣，1600μA的電刺激預(yù)先作用于光損傷661W和Müller細(xì)胞共培養(yǎng)組

4、之后，從共培養(yǎng)后3 h開(kāi)始661W的細(xì)胞死亡率顯著降低，并逐漸加大降低幅度直到共培養(yǎng)后24 h。TUNEL染色則顯示共培養(yǎng)后24 h，電刺激干預(yù)組的TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞比率較未干預(yù)組明顯減少。免疫熒光染色也提示了光損傷661W細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞干預(yù)組的661W較未干預(yù)組細(xì)胞形態(tài)改變程度輕，細(xì)胞間隙更小。另一方面，我們也將電刺激總用于光損傷后單獨(dú)培養(yǎng)的661W細(xì)胞，并在相同時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行LDH、TUNEL及免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，但結(jié)果與作用于共

5、培養(yǎng)體系的電刺激不同，電刺激干預(yù)并未減輕661W細(xì)胞的凋亡。
　　 本部分的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，電刺激能夠減輕強(qiáng)光照射引起的感光細(xì)胞凋亡變性，但感光細(xì)胞本身對(duì)電刺激并沒(méi)有反應(yīng)，可能電刺激改變了膠質(zhì)細(xì)胞的活性，而膠質(zhì)細(xì)胞活性的改變轉(zhuǎn)而影響了感光細(xì)胞的存活。
　　 第二部分：光損傷誘導(dǎo)感光細(xì)胞變性激活視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞，激活的膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)而影響光損傷感光細(xì)胞凋亡的作用
　　 成功建立了光損傷誘導(dǎo)感光細(xì)胞變性的模型后，我們進(jìn)一

6、步利用膠質(zhì)細(xì)胞與光損傷感光細(xì)胞共培養(yǎng)體系(未干預(yù)組)探索小膠質(zhì)細(xì)胞和Müller細(xì)胞受光損傷感光細(xì)胞影響后的數(shù)量、形態(tài)學(xué)的改變以及相伴隨的功能的變化，同時(shí)探索平行的661W細(xì)胞的生存狀態(tài)變化。正常661W細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞或Müller細(xì)胞共培養(yǎng)組視為正常對(duì)照組。在共培養(yǎng)24 h后利用免疫熒光染色觀察兩組小膠質(zhì)細(xì)胞或Müller細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)學(xué)的差異；同時(shí)利用Real-time PCR和Western blot法在共培養(yǎng)后3 h，6 h，

7、12 h，24 h對(duì)兩組小膠質(zhì)細(xì)胞所分泌的促炎因子IL－1β、TNF-α以及Müller細(xì)胞所分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、CNTF的基因表達(dá)量和蛋白分泌量?jī)山M差異以及時(shí)間趨勢(shì)變化進(jìn)行定量分析。并且運(yùn)用LDH、TUNEL及免疫熒光染色等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)單獨(dú)培養(yǎng)光損傷661W細(xì)胞和與小膠質(zhì)細(xì)胞或Müller細(xì)胞共培養(yǎng)的661W細(xì)胞壞死和凋亡率的差異。
　　 結(jié)果顯示：免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與正常661W細(xì)胞共培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞成靜息狀態(tài)，形態(tài)成

8、分支狀，突觸長(zhǎng)，胞體較小，而與光損傷661W細(xì)胞共培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞成激活狀態(tài)，形態(tài)成阿米巴樣或圓形，突觸短，胞體大，且數(shù)量較正常對(duì)照組增多。兩組Müller細(xì)胞的形態(tài)則無(wú)顯著差異。另外，在共培養(yǎng)后的24 h，Real-time PCR和Western blot顯示與光損傷661W共培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β和TNF-α的基因和蛋白表達(dá)量較正常對(duì)照組顯著上升，與光損傷661W共培養(yǎng)的Müller細(xì)胞BDNF和CNTF的基因和蛋白表達(dá)量也較

9、正常對(duì)照組明顯上調(diào)；蛋白量-時(shí)間趨勢(shì)曲線則發(fā)現(xiàn)在正常對(duì)照組中，小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的IL-1β和TNF-α在共培養(yǎng)后3 h至24 h時(shí)間段內(nèi)基本保持穩(wěn)定且較低的水平。而相反的，與光損傷661W共培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的IL-1β蛋白量則隨著時(shí)間進(jìn)展逐步升高，在共培養(yǎng)后24 h達(dá)到最高峰；同樣，其所分泌的TNF-α蛋白量也隨著時(shí)間上調(diào)，在共培養(yǎng)后12 h達(dá)到最高峰，之后到24 h時(shí)間段內(nèi)略微下降。另一方面，正常對(duì)照組中的Müller細(xì)胞分泌的BD

10、NF、CNTF蛋白量-時(shí)間曲線顯示BDNF蛋白量隨時(shí)間呈現(xiàn)逐漸衰減的趨勢(shì)，而CNTF則相對(duì)保持穩(wěn)定。然而與光損傷661W共培養(yǎng)的Müller細(xì)胞分泌的BDNF蛋白量迅速上調(diào)，在共培養(yǎng)后的6 h達(dá)到最高峰，之后略有下降；其所分泌的CNTF則逐步平穩(wěn)上升。LDH、TUNEL等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示相較單獨(dú)培養(yǎng)的光損傷661W細(xì)胞，與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的光損傷661W細(xì)胞的壞死率隨著時(shí)間進(jìn)展顯著上升；而與Müller細(xì)胞共培養(yǎng)的光損傷661W細(xì)胞的壞死率

11、則明顯減低。
　　 本部分的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)光損傷誘導(dǎo)的感光細(xì)胞凋亡引發(fā)了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和Müller細(xì)胞的反應(yīng)性膠質(zhì)化，并伴隨著小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的促炎因子IL-1β和TNF-α和Müller細(xì)胞分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、CNTF的上調(diào)，并且小膠質(zhì)細(xì)胞的激活加重了661W細(xì)胞的損傷，而Müller細(xì)胞的反應(yīng)性膠質(zhì)化則減輕了661W細(xì)胞的凋亡，表明了膠質(zhì)細(xì)胞活性改變?cè)诠鈸p傷誘導(dǎo)感光細(xì)胞變性過(guò)程起著重要的作用。
　　 第三部分

12、：電刺激干預(yù)光損傷感光細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞激活的作用
　　 將1 h雙相方波、直流電刺激(3 ms，20 Hz，300～1600μ A)預(yù)先作用于光損傷661W和小膠質(zhì)細(xì)胞或Müller細(xì)胞共培養(yǎng)體系，視為干預(yù)組；將未接受電刺激的此共培養(yǎng)體系視為未干預(yù)對(duì)照組；正常661W細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞或Müller細(xì)胞共培養(yǎng)體系視為正常對(duì)照組。采用免疫熒光染色在共培養(yǎng)24 h后觀察各組小膠質(zhì)細(xì)胞及Müller細(xì)胞形態(tài)學(xué)、數(shù)量的差異；利用Re

13、al-time PCR和Westernblot法在共培養(yǎng)后3 h，6 h，12 h，24 h對(duì)各組小膠質(zhì)細(xì)胞所分泌的促炎因子IL-1β、TNF-α以及Müller細(xì)胞所分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、CNTF的基因表達(dá)量和蛋白分泌量?jī)山M差異以及時(shí)間趨勢(shì)變化進(jìn)行定量分析。
　　 結(jié)果顯示：免疫學(xué)熒光染色顯示的未干預(yù)對(duì)照組和正常對(duì)照組間的小膠質(zhì)細(xì)胞和Müller細(xì)胞形態(tài)學(xué)差別如第一部分所述，電刺激干預(yù)組的小膠質(zhì)細(xì)胞的阿米巴樣的活化數(shù)量則

14、較干預(yù)組明顯減少，并且一部分細(xì)胞雖然沒(méi)有出現(xiàn)像靜息狀態(tài)時(shí)的明顯的分支狀，但胞體呈扁平狀態(tài)，我們將其視作“中間狀態(tài)”；而電刺激干預(yù)組的Müller細(xì)胞則較未干預(yù)對(duì)照組和正常對(duì)照組的Müller細(xì)胞顯得胞體更大，胞體內(nèi)纖維組織更豐富，且細(xì)胞數(shù)量也明顯增多。伴隨著形態(tài)學(xué)的改變，Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示電刺激干預(yù)組中的小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β和TNF-α的基因和蛋白表達(dá)量較未干預(yù)組顯著降低，Müller細(xì)胞BDN

15、F和CNTF的基因和蛋白表達(dá)量較未干預(yù)組進(jìn)一步升高；蛋白量-時(shí)間趨勢(shì)曲線則顯示電刺激干預(yù)抑制了未干預(yù)組中小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β和TNF-α持續(xù)升高，分別在共培養(yǎng)后24 h和12 h降至最低最低點(diǎn)；而電刺激干預(yù)組中Müller細(xì)胞分泌的BDNF蛋白量較未干預(yù)組隨時(shí)間上升幅度進(jìn)一步加大；CNTF的分泌高峰則被提前至共培養(yǎng)后6 h，上升幅度增大并保持至共培養(yǎng)后24 h。
　　 這部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：電刺激能夠有效抑制由光損傷感光細(xì)胞誘導(dǎo)的