殼寡糖誘導(dǎo)Hela、A549細(xì)胞凋亡和自噬的研究.pdf

1、癌癥嚴(yán)重威脅人類健康，它的治療仍是醫(yī)學(xué)界的一大難題，因此，尋找一種新型抗腫瘤藥物具有重要意義。
　　殼寡糖（COS）具有很好的抗腫瘤活性，且無毒副作用，是抗腫瘤藥物的理想候選材料。不同聚合度的COS對腫瘤細(xì)胞的影響不同。為了明確COS對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，本研究利用金屬配位控制氧化降解殼聚糖的方法制備COS，采用不同濃度的殼寡糖分別處理Hela細(xì)胞、A549細(xì)胞12h和24h，MTT法檢測表明，隨著COS濃度升高、作用時間延長，對

2、細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈時間劑量依賴關(guān)系(P<0.01)，當(dāng)濃度為5.0mg·mL-1時對兩株細(xì)胞增殖的抑制率分別達(dá)到了52.15%和57.63%。推測COS對細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或自噬發(fā)生的。
　　為了分析COS對細(xì)胞凋亡的影響，本研究采用Wright's-Giemsa染色法和AO-EB染色法觀察COS處理Hela細(xì)胞、A549細(xì)胞后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞儀定量檢測COS處理后細(xì)胞凋亡情況，利用免疫

3、組化法分析凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和Survivin的表達(dá)。結(jié)果表明，Wright’s-Giemsa染色后Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞的細(xì)胞膜褶皺，細(xì)胞核固縮，并出現(xiàn)凋亡小體。熒光顯微鏡下觀察COS處理、AO-EB染色的Hela細(xì)胞、A549細(xì)胞，細(xì)胞固縮的橘紅色凋亡細(xì)胞增多。AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測凋亡細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，COS處理Hela細(xì)胞24h時凋亡率為31.8%，處理A549細(xì)胞24h時凋亡率為37.8%。免疫組化

4、分析表明，COS能夠上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抑制凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表達(dá)。這些結(jié)果表明，COS對細(xì)胞增殖的抑制作用與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)。
　　COS是否誘導(dǎo)細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)？本文利用COS處理Hela細(xì)胞、A549細(xì)胞后，應(yīng)用MDC熒光染色、LC3免疫熒光染色法、以及Western-blot法檢測COS分別處理細(xì)胞4h、8h、12h后細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果表明，處理后的Hela細(xì)胞、A

5、549細(xì)胞MDC染色后細(xì)胞核周區(qū)域熒光強(qiáng)度增加，推測可能是細(xì)胞內(nèi)自噬泡數(shù)或自噬體數(shù)增多。免疫熒光染色法觀察COS處理后的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均出現(xiàn)亮點(diǎn)狀熒光顆粒，表明細(xì)胞內(nèi)LC3的表達(dá)量增加，且自噬體數(shù)量增多。Western-blot法檢測COS處理Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞4h時LC3Ⅰ的表達(dá)量明顯多于LC3Ⅱ；處理8h時，LC3Ⅰ量減少，而LC3Ⅱ量增加；處理12h時，可以明顯觀察到LC3Ⅰ絕大部分轉(zhuǎn)變?yōu)長C3Ⅱ。這個結(jié)果表明，隨著COS處理時