miRNA-200b影響失巢凋亡的機(jī)制及其表達(dá)的自我調(diào)節(jié).pdf

1、miRNAs是一類19-23nt的小分子非編碼RNA。一般認(rèn)為，miRNAs通過作用于mRNA的3'UTR區(qū)域在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的蛋白表達(dá)。據(jù)推測，大約40％的基因都受到miRNA的調(diào)節(jié)，因此也就不難理解miRNA廣泛參與了機(jī)體內(nèi)各種生理及病理過程。大量的研究表明，miRNA表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　 miRNA-200s家族成員包括5個成員，按其功能又能被分為兩大類，即:miRNA-200a,miRNA-14

2、1和miRNA-200b,miRNA-200c以及miRNA-429。miRNA-200s通過作用于E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制因子ZEB1/ZEB2的3'UTR區(qū)調(diào)節(jié)其蛋白表達(dá)。miRNA-200s表達(dá)的降低使得E-cadherin表達(dá)減少，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，即上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換的發(fā)生。E-cadherin作為一種上皮黏附分子，其主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間以及細(xì)胞與胞外基質(zhì)之間的相互作用。E-cadherin表達(dá)的降低使得癌細(xì)胞

3、易于從原發(fā)病灶脫落，從而為腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供了先決條件。
　　 正常情況下，細(xì)胞脫離細(xì)胞外基質(zhì)后，一般都會經(jīng)歷失巢凋亡的過程。這也是機(jī)體維持生理穩(wěn)態(tài)的一種重要機(jī)制。目前認(rèn)為，失巢凋亡是腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的一個障礙。因此，腫瘤細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移必需具備抵抗失巢凋亡的能力。然而，miRNA-200s家族成員是否具備調(diào)節(jié)失巢凋亡的功能，目前尚未見報道。
　　 本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，在MDA-MB-231細(xì)胞中過表達(dá)miRNA-200

4、b能誘導(dǎo)失巢凋亡的發(fā)生。通過計算機(jī)軟件分析（miRBase及TrgetScan等）發(fā)現(xiàn)Pin1（肽基-脯氨酰順反異構(gòu)酶）是miRNA-200b的靶基因之一。進(jìn)一步的分子生物學(xué)實驗表明，miRNA-200b能在翻譯水平調(diào)節(jié)Pin1的蛋白表達(dá)。通過miRNA-200b與Pin1的共表達(dá)實驗證明，miRNA-200b調(diào)節(jié)失巢凋亡的功能至少部分依賴于其對Pin1的調(diào)節(jié)作用。同時，我們也證明了miRNA-200b是通過Pin1-pERK/pAKT

5、信號途徑來調(diào)節(jié)失巢凋亡的。
　　 Promoter區(qū)轉(zhuǎn)錄因子分析表明，miRNA-200b的表達(dá)可能受到ETS家族的兩個成員-PEA3及ELK-1的調(diào)節(jié)?；诖?，我們采用siRNA敲降PEA3及ELK-1的表達(dá)，結(jié)果顯示，PEA3能促進(jìn)miRNA-200b的表達(dá)，而ELK-1則是miRNA-200b的轉(zhuǎn)錄抑制因子。進(jìn)一步，基于pERK能調(diào)節(jié)ELK-1的磷酸化以及PEA3的sumo化，我們推測，miRNA-200b可能能通過其對P

6、in1的調(diào)節(jié)作用而實現(xiàn)其表達(dá)的自我調(diào)節(jié)。因此，我們在過表達(dá)miRNA-200b后再輔以EGF刺激處理，采用Western blot及IP的實驗方法證實，通過Pin1-pERK信號途徑，miRNA-200b與PEA3-sumoylation及pELK-1之間形成正、負(fù)兩個反饋循環(huán)從而實現(xiàn)了其對自我表達(dá)的調(diào)節(jié)。
　　 腫瘤細(xì)胞在脫離原發(fā)病灶發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的過程中是處于失巢狀態(tài)的。已有的研究表明，處于失巢狀態(tài)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)處

7、于凋亡-增殖的平衡狀態(tài)。因此，我們將MCF-7細(xì)胞懸浮在poly-HEMA包被的培養(yǎng)皿中進(jìn)行模擬失巢狀態(tài)的培養(yǎng)，以觀察miRNA-200b及Pin1的表達(dá)水平是否發(fā)生改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在失巢狀態(tài)下，miRNA-200b的表達(dá)水平明顯降低，同時Pin1的蛋白表達(dá)水平則表現(xiàn)出相應(yīng)的增高。先前的研究表明，miRNA-200b也能調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖。同時，我們在失巢培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了Cyclin D1表達(dá)的降低，后者也受到miRNA-20

8、0b的調(diào)節(jié)。因此，我們推測，miRNA-200b可能在CTCs的凋亡-增殖平衡中發(fā)揮作用。
　　 在人乳腺癌組織標(biāo)本中，我們通過Real-time quantitative PCR及Western blot的方法檢測了miRNA-200b及Pin1蛋白的表達(dá)水平，統(tǒng)計學(xué)分析表明，miRNA-200b在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的表達(dá)明顯低于非轉(zhuǎn)移性乳腺癌(p＜0.01)，而Pin1蛋白的表達(dá)情況則相反(p＜0.01)。并且，miRNA-20