CCR2在MCP-1誘導人內皮細胞凋亡中的作用.pdf

1、目的：研究趨化因子受體2（CCR2）在單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）誘導人臍靜脈內皮細胞株（CRL-1730）凋亡中的作用并初步探討蛋白激酶C（PKC）信號傳導通路對MCP-1誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡的影響。 方法：第一部分：培養(yǎng)并鑒定人臍靜脈內皮細胞；用不同濃度單核細胞趨化蛋白-1（0．1ng/ml，1．0ng/ml，10ng/ml，100ng/ml）對其作用24h后，Western blot法檢測CCR2蛋白表達量的變化

2、；設計CCR2正義寡核苷酸鏈、反義寡核苷酸鏈及與人類基因非同源性的寡核苷酸序列，運用反義寡核苷酸技術以脂質體為載體將CCR2正義寡核苷酸鏈、反義寡核苷酸鏈及與人類基因非同源性的寡核苷酸序列轉染人臍靜脈內皮細胞，Western Blot檢測轉染后MCP-1誘導的CCR2蛋白的表達、流式細胞術檢測細胞凋亡率。第二部分：加入CCR2的阻斷劑RS102895后，用MCP-1作用細胞，激光掃描共聚焦顯微鏡原位檢測細胞凋亡；Annexin V-FI

3、TC/PI雙染流式細胞術觀察加入不同劑量RS102895后MCP-1誘導的細胞凋亡率。第三部分：用不同濃度的PKC激動劑PMA與PKC抑制劑chelerythrine分別作用人臍靜脈內皮細胞后，再用10ng/ml的MCP-1誘導，流式細胞術檢測細胞凋亡率。 結果：培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞株經免疫熒光鑒定Ⅷ抗體陽性，證明為內皮細胞；MCP-1（0．1ng/ml，1．0 ng/ml，10 ng/ml，100 ng/ml）能誘導人臍靜脈

4、內皮細胞中受體CCR2蛋白的表達，其效應隨濃度的增加而增加；熒光倒置顯微鏡與流式細胞術確定0．4μg/μl FITC標記的CCR2反義寡核苷酸作用CRL-1730細胞48h為最佳轉染效率；CCR2反義寡核苷酸轉染后可明顯抑制CCR2蛋白表達（P<0．05），對MCP-1誘導的hUVECs凋亡有明顯抑制作用。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到加入CCR2阻斷劑組比只加入MCP-1作用組細胞凋亡數明顯減少；流式細胞技術檢測加入CCR2阻斷劑對MCP

5、-1誘導的CRL-1730細胞凋亡有明顯的抑制作用，并隨RS102895劑量的增加細胞的凋亡率逐漸降低（P<0．01，P<0．01，P<0．01）．不同濃度的PMA（1×10-4mmol/L、1×10-3mmol/L）能增強MCP-1誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡，凋亡效應隨劑量增加而增強（P<0．05，P<0．01）。不同濃度的PKC抑制劑chelerythrine并非都能抑制MCP-1誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡，在抑制劑濃度為1×10-