c-Ski基因?qū)π×和ǖ婪克饬髯枇Φ恼{(diào)控及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:
　　原發(fā)性開角型青光眼(primaryopenangleglaucoma,POAG)是眼睛疾病當(dāng)中遲發(fā)性、進(jìn)行性且不可逆的主要致盲眼病之一,目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚,但一般認(rèn)為眼壓升高是其中主要的危險因素。因此,降眼壓一直是眼科治療青光眼的主要手段?，F(xiàn)今大多數(shù)降眼壓藥物療效不理想,且有一定的副作用。一旦患上青光眼就需要長期用藥,因此也存在高額費(fèi)用及治療的依從性不佳等問題。此外,就藥物作用機(jī)理而言,除膽堿能激動劑(如

2、匹羅卡品)外,其他降眼壓藥并未針對房水的主要排出通道即小梁通道起作用。因而,在目前降眼壓治療存在許多問題的情況下,基因治療的引入有特殊的意義。本課題將TGF-β/Smad信號通路輔阻遏因子c-Ski基因?qū)氪笫笄胺?探討c-Ski基因表達(dá)對大鼠眼壓的影響、可能的機(jī)制和轉(zhuǎn)基因表達(dá)的副作用。以上研究國內(nèi)外尚無報(bào)道。該項(xiàng)課題可望闡明用c-Ski基因治療青光眼的可行性,為廣大青光眼患者的治療帶來新的希望!研究目的包括:
　　1、構(gòu)建c-S

3、ki基因的慢病毒表達(dá)載體,在293TN細(xì)胞中合成和收獲病毒;
　　2、慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)小梁細(xì)胞,探討c-Ski在細(xì)胞水平的表達(dá)及其可能的影響眼壓機(jī)制;
　　3、將病毒一次性導(dǎo)入大鼠前房,觀察c-Ski的表達(dá)對眼壓的影響及眼內(nèi)毒性反應(yīng)等,初步探討c-Ski影響眼壓的機(jī)制。
　　方法:
　　1.構(gòu)建同時表達(dá)c-Ski和GFP基因的慢病毒載體(HIV-c-Ski/GFP),并證實(shí)在細(xì)胞水平上表達(dá)目的蛋白;僅表達(dá)GFP基因的慢

4、病毒載體(HIV-GFP)作為對照,下同。包裝成具有感染(轉(zhuǎn)導(dǎo))能力的病毒顆粒。
　　2.HIV-c-Ski/GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)的人眼小梁細(xì)胞(trabecularmeshworkcells,TMCs);觀察轉(zhuǎn)基因表達(dá)的時間及其對細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞外基質(zhì)、肌動蛋白細(xì)胞骨架及其細(xì)胞連接的影響。
　　3.采用SD大鼠做實(shí)驗(yàn)。HIV-c-Ski/GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)大鼠眼,與對照相比,檢測轉(zhuǎn)基因表達(dá)對眼壓的影響,轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物在小梁通道表達(dá)及其對小梁大

5、體形態(tài)的影響,并觀察可能存在的副作用如炎癥反應(yīng)等。
　　結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建pCDF1-MCS2-EF1-copGFP-C-Ski表達(dá)載體,經(jīng)酶切和測序鑒定,僅有一處堿基改變,即第1476位的C突變?yōu)門,但不影響所編碼的氨基酸,其他序列完全相同。經(jīng)293TN細(xì)胞包裝后收獲了病毒HIV-c-Ski和HIV-GFP,病毒滴度均為3.4×108TU/ml。
　　2、Western-blot結(jié)果顯示:Ski在HIV-c-S

6、ki、HIV-GFP感染小梁細(xì)胞及未處理小梁細(xì)胞中均有表達(dá)。HIV-c-Ski感染的小梁細(xì)胞Ski表達(dá)增強(qiáng),證實(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)成功。免疫熒光結(jié)果顯示,和HIV-GFP組和空白細(xì)胞組相比,HIV-c-Ski人小梁細(xì)胞肌動蛋白骨架降解,β-catenin蛋白表達(dá)減弱。
　　3、治療組和對照組的基線眼壓(10:00～11:00)分別為13.02±0.48mmHg和13.05±0.52mmHg,差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,n=12)。病毒注射后

7、第11天,治療組眼壓開始下降,與對照組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);第13天開始,治療組眼壓與基線眼壓及對照組眼壓相比,差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);之后治療組眼壓持續(xù)下降,穩(wěn)定在一個相對低水平,直至第21天處死。納入的12只大鼠未見明顯的角膜、前房炎癥反應(yīng)及其它眼部異常。
　　4、免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:大鼠前房注射病毒后4周,實(shí)驗(yàn)組小梁網(wǎng)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)和細(xì)胞肌動蛋白骨

8、架蛋白均表達(dá)減弱。
　　結(jié)論:
　　1、成功構(gòu)建pCDF1-MCS2-EF1-copGFP-c-Ski慢病毒表達(dá)載體,在293TN細(xì)胞中包裝得到具有感染能力的病毒顆粒。
　　2、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)小梁細(xì)胞,在小梁細(xì)胞中表達(dá)c-Ski,并經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)和Western-blot證實(shí),c-Ski基因可引起人小梁細(xì)胞肌動蛋白骨架的降解及細(xì)胞連接蛋白β-catenin表達(dá)減少。
　　3、慢病毒介導(dǎo)的c-Ski在大鼠小梁網(wǎng)ECM蛋白