白藜蘆醇納米乳的研制及誘導(dǎo)體外HepG2凋亡的研究.pdf

1、目的：制各白藜蘆醇納米乳，并進行質(zhì)量評價；探討其對體外培養(yǎng)的人肝癌細胞株HepG2的誘導(dǎo)凋亡作用和對大鼠肝細胞的毒性。 方法：(1)選用非離子型表面活性劑蓖麻油聚氧乙烯醚(EL-40)、聚氧乙烯醚(40)氫化蓖麻油(RH-40)、Tween80、Span80，采用三元相圖法篩選處方并考察影響納米乳形成的影響因素，對各處方的理化特性、穩(wěn)定性進行考察。(2)以肉豆蔻酸異丙酯(IPM)為油相、無水乙醇為助表面活性劑，采用偽三元相圖從E

2、L-40和RH-40中篩選最合適的表面活性劑來制備白藜蘆醇納米乳。用紫外分光光度法建立白藜蘆醇含量檢測方法，并對白藜蘆醇納米乳的理化性質(zhì)和穩(wěn)定性進行考察。(3)MTT法檢測白藜蘆醇納米乳對HepG2細胞的毒性；克隆形成試驗觀察其對單個細胞增殖的影響；并測定其對HepG2細胞生長曲線的影響；通過倒置顯微鏡、HE染色、電子掃描顯微鏡觀察其對HepG2細胞的形態(tài)學(xué)變化；流式細胞儀檢測其對細胞周期影響；通過測定細胞培養(yǎng)液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶

3、、乳酸脫氫酶的含量，檢測其對HepG2細胞膜通透性的影響。(4)消化法培養(yǎng)大鼠肝細胞，MTT法檢測白藜蘆醇納米乳對正常大鼠肝細胞的毒性，通過測定細胞培養(yǎng)液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶的含量，檢測其對正常肝細胞膜通透性的影響。 結(jié)果：(1)表面活性劑、助表面活性劑、油相、表面活性劑和助表面活性劑的比值(Km)等對納米乳的形成均有影響。空白納米乳平均粒徑為10.7±1.2nm，各處方的納米乳粒徑均小于100nm。高速離心和恒

4、溫加速試驗表明，各處方經(jīng)13,000 rpm,30min、40±2℃及相對濕度75±5％的條件下放置6個月均能保持外觀澄清透明，無分層和絮凝現(xiàn)象。(2)以RH-40為表面活性劑制備的白藜蘆醇納米乳的納米乳區(qū)大于以EL-40為表面活性劑制備的納米乳區(qū)；納米乳形狀為球形，平均粒徑為17.6±0.9 nm，大小在1～100nm之間，且分布均勻；白藜蘆醇納米乳樣品中白藜蘆醇的濃度為6.184±0.143mg．mL-1；在2～12μg．mL-1內(nèi)

5、，線性關(guān)系良好，r=0.9990，平均回收率為95.8％，日內(nèi)和日間精密度的RSD均小于0.25％；白藜蘆醇納米乳經(jīng)離心試驗和加速試驗均能保持外觀、pH值和含量穩(wěn)定；納米乳基質(zhì)對具有很好的保護作用。(3)白藜蘆醇納米乳與白藜蘆醇原料藥相比，當白藜蘆醇濃度大于8 mg．L-1作用HepG2細胞48h后，細胞抑制率顯著增加(p<0.05)，IC50分別為：6.5mg．L-1和24.2mg．L-1；經(jīng)4mg．L-1白藜蘆醇原料藥和4mg．L-

6、1白藜蘆醇納米乳處理人肝癌細胞系HepG23d后，細胞數(shù)量顯著少于正常培養(yǎng)的細胞(p<0.01)，在4d后，白藜蘆醇原料藥處理的細胞數(shù)顯著多于白藜蘆醇納米乳處理后的細胞數(shù)(P<0.01)；8mg．L-1白藜蘆醇納米乳作用HepG2細胞24h，細胞形態(tài)學(xué)上出現(xiàn)明顯的凋亡特征，使細胞阻滯在S/G2期，但各組谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶的含量未有明顯的變化。(4)白藜蘆醇納米乳與白藜蘆醇原料藥對正常大鼠肝細胞沒有明顯的毒性作用，各組谷丙