人結腸癌SW620細胞上清作用下樹突狀細胞內(nèi)皮樣分化的研究.pdf

1、授予單位代碼學號或申請?zhí)?0459200612026100104004級公翁.文學論大位州學鄭士碩(科學學位)人結腸癌SW620細胞上清作用下樹突狀細胞內(nèi)皮樣分化的研究院系名稱:鄭州大學基礎醫(yī)學院學科門類:醫(yī)學專業(yè)名稱:病理學與病理生理學作者姓名:白睿華導師姓名、職稱:董子明教授2009年05月26日鄭州大學2009屆碩士學位論文中文摘要研究發(fā)現(xiàn)結腸癌SW62o細胞上清能抑制未成熟nes(immaturedend‘tieee一15，iD

2、Cs)的生長過程及相關抗原表達，并且未成熟DCs在SW620細胞上清誘導下發(fā)生內(nèi)皮樣分化。這些研究揭示在腫瘤相關環(huán)境下DCs在抗腫瘤免疫方面受到抑制，部分DCS還發(fā)生內(nèi)皮樣分化。國內(nèi)外近年來關于DCS的研究多集中于如何提高DCs抗腫瘤的免疫功能等方面，而腫瘤微環(huán)境下DCS的內(nèi)皮樣分化發(fā)生及其機制等還有待于進一步的研究。目的:本實驗探討結腸癌細胞SW62O分泌的可溶性細胞因子營造的微環(huán)境對人外周血單個核細胞來源的不同時期DCs發(fā)生內(nèi)皮樣分

3、化的影響，以及MAPKERK信號途徑在此過程中的激活情況。實驗方法:1.制備結腸癌SW62O細胞上清液。2.采集健康志愿者新鮮外周血，密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞，即Ml1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為3x106ml，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml，移入二氧化碳孵育箱(5%COZ，37℃)靜置3h，去除懸浮細胞，獲取貼壁生長的單核細胞，加入含thGM一eSF(100nginl)、IL一4(sn留ml)和10%自體血清的1640

4、培養(yǎng)液，第5d加入LPs(5n歲ml)。誘導組除加入上述培養(yǎng)液外，分別于第Zd(未成熟DCs誘導組)、第7d(成熟DCs誘導組)分組加入sW62o細胞上清液。隔天半量換液，各誘導7d。分別于第9d和14d收集誘導組細胞和對照組DCs。培養(yǎng)過程中觀察細胞形態(tài)并計數(shù)提取各組細胞總蛋白，Westemblotting檢測內(nèi)皮細胞特異性標志vWF、VE一cadherin的表達情況透射電鏡觀察WP小體增殖及殺傷實驗觀察誘導后細胞抗原呈遞功能的改變乙

5、酞化低密度脂蛋白攝取實驗(DIL一Ac一LDLuPtakeassav)了解誘導后細胞是否具有內(nèi)皮細胞的功能westemblotting檢測sW62o細胞上清液對未成熟DCs刺激后15、30、60min的E雙122水平的影響。使用ERKI2上游激酶MEK的阻斷劑PD98059，觀察MAP玲ERK通路阻斷后，SW620細胞上清誘導組細胞vWF、VE一cadherin的蛋白表達情況和DIL一Ac一LDL攝取功能。3.胰蛋白酶法配合內(nèi)皮細胞培養(yǎng)