樹突狀細(xì)胞在結(jié)腸癌細(xì)胞SW620上清液作用下內(nèi)皮樣分化傾向的研究.pdf

1、研究背景：樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)是在機體的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用的細(xì)胞群體,其傳統(tǒng)的抗原提呈功能近年來已得到廣泛的研究。DC的APC功能即在體內(nèi)激活T細(xì)胞反應(yīng)。DC不僅提成抗原給未致敏的T細(xì)胞誘發(fā)其反應(yīng),而且還能產(chǎn)生刺激分子使靜止的T細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期并刺激它們的活化。然而,多數(shù)研究證實腫瘤浸潤性樹突狀細(xì)胞的表型及其遞呈功能均下降,腫瘤組織分泌多種免疫因子均能抑制DC的成熟,例如IL-10,VEGF或IL-

2、6和M-CSF等。因此,DC的數(shù)量及功能成熟與否與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。腫瘤血管形成是腫瘤迅速生長重要標(biāo)志。傳統(tǒng)理論認(rèn)為只有通過血管新生(angiogenesis)即預(yù)存的內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)發(fā)芽形成毛細(xì)血管;血管發(fā)生(vasculogenesis)主要在胚胎期,近來研究表明血管發(fā)生在成年生物也可實現(xiàn),腫瘤的血管化作用也包括血管發(fā)生,即內(nèi)皮細(xì)胞從不成熟的前體細(xì)胞發(fā)育而來。目前認(rèn)為,bFGF、VEGF、HGF與腫瘤血管形成有關(guān)。2004年《Nat

3、ure Medicine》報道Coukos G等在小鼠及人的卵巢癌上發(fā)現(xiàn)了一種新型的共表達(dá)DC和血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志的白細(xì)胞群,接著有學(xué)者提出了腫瘤相關(guān)DC在腫瘤微環(huán)境作用下可能發(fā)生內(nèi)皮樣分化。這些研究揭示在腫瘤相關(guān)環(huán)境下DC在抗腫瘤免疫方面受到抑制,部分DC還可能發(fā)生內(nèi)皮樣分化,參與腫瘤血管的形成,促進(jìn)腫瘤生長。國內(nèi)外近年來關(guān)于DC的研究多集中于如何提高DC抗腫瘤的免疫功能等方面,而腫瘤微環(huán)境下DC的內(nèi)皮樣分化傾向發(fā)生及其機制以及如何參

4、與腫瘤血管的形成等還有待于進(jìn)一步的研究。
　　目的：本實驗探討結(jié)腸癌細(xì)胞SW620分泌的可溶性細(xì)胞因子營造的微環(huán)境對人單個核細(xì)胞來源的不同時期樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)分化發(fā)育的影響,以及是否發(fā)生內(nèi)皮樣分化的傾向。
　　實驗方法：1.制備結(jié)腸癌細(xì)胞SW620培養(yǎng)上清液。2.采集健康志愿者新鮮外周血,密度梯度離心法分離人外周血單個核細(xì)胞,RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106/ml,接種于

5、24孔培養(yǎng)板中,每孔1ml,移入二氧化碳孵育箱(5％CO2,37℃)靜置3h,去除懸浮細(xì)胞,獲取貼壁生長的單核細(xì)胞,加入含GM-CSF(100 ng/ml)、IL-4(5ng/ml)和10％自體血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)DC,誘導(dǎo)組除加入上述培養(yǎng)液外,分別于第2d、7d分組加入SW620培養(yǎng)上清液,隔天半量換液,各誘導(dǎo)7d。分別于第10d和14d收集誘導(dǎo)組DC和對照組DC。3.培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞形態(tài)并計數(shù)。各組經(jīng)熒光素標(biāo)記抗體后,采用流式

6、細(xì)胞技術(shù)檢測其免疫表型CD86,CD1a,CD11c;免疫熒光法檢測各組內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志vWF的表達(dá)情況;采用RT-PCR檢測各組特異標(biāo)記(CD1a、vWF和CD144)的基因表達(dá);顯微鏡觀察鋪有纖維粘連蛋白玻片上各組細(xì)胞條索樣結(jié)構(gòu)形成情況。4.胰蛋白酶法配合內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,作為陽性對照組。采用統(tǒng)計學(xué)軟件包SPSS12.0進(jìn)行結(jié)果的統(tǒng)計分析,將所得計量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示,確定方差齊性后,進(jìn)行t

7、檢驗或方差分析,P<0.05為顯著性差異。
　　結(jié)果：1.正常DC在培養(yǎng)第3d開始出現(xiàn)突起,第5d時突起更加明顯,并且第7d大量突起交織,之后細(xì)胞逐漸增大變圓,出現(xiàn)懸浮趨勢。SW620培養(yǎng)上清液的2d實驗組細(xì)胞生長過程及其狀態(tài)明顯落后于正常對照組,并且細(xì)胞密度較低;而7d誘導(dǎo)組細(xì)胞與DC對照組無明顯差別。2.流式檢測結(jié)果:2d誘導(dǎo)組的未成熟DC經(jīng)SW620培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)7d后,DC的特異標(biāo)記CD86、CD1a、CD11c與正常對照

8、組DC相比,表達(dá)率均明顯下降且兩組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。7d誘導(dǎo)組的相對成熟DC誘導(dǎo)7d后,與其相對的正常組比較,DC特異標(biāo)記表達(dá)率未見有明顯下降,而二組間也無統(tǒng)計學(xué)差異。3.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測內(nèi)皮細(xì)胞特異標(biāo)志vWF結(jié)果:用SW620培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)的2d誘導(dǎo)組中存在胞漿著色的陽性細(xì)胞,提示有vWF的表達(dá),而7d誘導(dǎo)組和正常對照組胞漿著色不明顯,而且2d誘導(dǎo)組的陽性區(qū)面積百分比和陽性區(qū)平均灰度高于其相應(yīng)正常對照組,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;

9、7d誘導(dǎo)組與其相應(yīng)正常對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義。4.RT-PCR檢測各組特異標(biāo)記的基因表達(dá)結(jié)果:早期2d誘導(dǎo)組細(xì)胞目的基因條帶中有CD144、vWF,而CD1a缺失;其相應(yīng)的正常對照組有CD1a基因的表達(dá),而CD144、vWF低表達(dá)。7d誘導(dǎo)組與其相應(yīng)的正常組比較均有CD1a的表達(dá),CD144、vWF表達(dá)不明顯。5.顯微鏡觀察條索樣結(jié)構(gòu):2d誘導(dǎo)組細(xì)胞在鋪有纖維粘連蛋白的96孔板里形成相似于HUVEC陽性對照組的條索樣結(jié)構(gòu);而正常組DC和