膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞G蛋白-AC-cAMP與Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的交叉對(duì)話及芍藥苷的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種多因素引起的慢性、系統(tǒng)性炎癥疾病。其主要特征是滑膜炎癥，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞和變形。研究證明促炎癥細(xì)胞因子如白介素-1 （IL-1)、腫瘤壞死因子( TNF-α)和炎癥介質(zhì)如前列腺素E2(PGE2)在RA發(fā)病中起到重要作用。調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和破壞性酶產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也參與了RA的病理過(guò)程，并呈現(xiàn)潛在的治療靶點(diǎn)，如異三聚體鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白(G protein)和絲裂原活化蛋白激酶( MAPKs)等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)都參與了RA慢性滑膜

2、炎。 本研究建立大鼠CIA模型，分離培養(yǎng)FLS，分別采用rIL-1α(一個(gè)炎癥細(xì)胞因子)、U0126(MEK1/2選擇性抑制劑)、鹽酸異丙腎上腺素(β受體激動(dòng)劑)和氨茶堿(Ami），非選擇性磷酸二脂酶(PDEs)抑制劑作用于FLS，首次探討Ras-Raf-MEK-ERK和G蛋白-AC-cAMP兩信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)交叉對(duì)話的關(guān)鍵位點(diǎn)及Pae調(diào)節(jié)兩信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)交叉對(duì)話的作用環(huán)節(jié)。 目的： 1.Iso和Ami分別作用于CIA大鼠FL

3、S，檢測(cè)FLS中Ras，Raf,p-MEK1/2和p-ERK1/2表達(dá)變化，rIL-1α和U0126分別作用于CIA大鼠FLS，檢測(cè)FLS中Gi表達(dá)、cAMP水平和蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)活性，探討兩信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的交叉對(duì)話及關(guān)鍵作用交叉位點(diǎn)。 2.根據(jù)FLS中Ras，Raf,p-MEK1/2，p-ERK1/2，Gi，cAMP水平和PKA活性的變化，觀察CIA大鼠FLS在Ami，rIL-1或U0126分別

4、作用下，Pae對(duì)Ras-MAPKs和G蛋白-AC-cAMP兩信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)交叉對(duì)話的影響及通過(guò)哪些環(huán)節(jié)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。 方法： 用雞Ⅱ型膠原(type Ⅱ collagen，C Ⅱ)免疫Sprague-Dawley(SD)大鼠誘導(dǎo)CIA。在炎癥出現(xiàn)后，灌胃給予CIA大鼠Pae(25，50，100 mg·kg-1)，每天一次。大鼠體重每隔4天稱重一次。用MK-550容積儀每隔4天測(cè)量大鼠右后足爪容積。采用0-4分尺度每隔4天評(píng)定關(guān)

5、節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)。進(jìn)行大鼠膝關(guān)節(jié)組織病理分析。分離和培養(yǎng)FLS。FLS被不同的激動(dòng)劑、抑制劑或藥物作用如Iso，Ami，rIL-1，U0126或Pae。采用3H-TdR摻入法檢測(cè)IL-1的活性。TNF-α和PGE2的產(chǎn)生分別采用125I放免試劑盒測(cè)定。運(yùn)用免疫組化和Western blotting技術(shù)檢測(cè)滑膜細(xì)胞中Gi，Ras，Raf,p-MEK1/2和P-ERK1/2的表達(dá)。用競(jìng)爭(zhēng)蛋白結(jié)合分析法(com

6、petitive proteinbinding assay,CPBA)檢測(cè)滑膜細(xì)胞中cAMP水平，用激酶發(fā)光分析法測(cè)定滑膜細(xì)胞中PKA的活性。 結(jié)果： I.CIA大鼠FLS中Ras-MAPKs與G蛋白-AC-cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的交叉對(duì)話及關(guān)鍵作用交叉位點(diǎn)1.大鼠CIA建立與評(píng)價(jià)。在CIA大鼠中可見(jiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，體重增長(zhǎng)緩慢，足爪腫脹，關(guān)節(jié)炎指數(shù)升高，伴有關(guān)節(jié)滑膜組織增生、血管翳形成和軟骨侵蝕。IL-1活性增強(qiáng)，TNF-α

7、和PGE2的產(chǎn)生增加。 2.CIA大鼠FLS中Gi，Ras，Raf,p-MEK1/2和P-ERK1/2的表達(dá)。CIA大鼠FLS中Gi，Ras，Raf,p-MEK1/2和P-ERK1/2表達(dá)增加。Gi，Ras，Raf和p-ERK1/2的表達(dá)在d20至d28較高，在d20前后P-MEK1/2的表達(dá)較高。 3.Ras-MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)G蛋白-AC-cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。rIL-1α可促進(jìn)Ras，Raf,p-MEK1/2和P-ER

8、K1/2的表達(dá)，提高Gi蛋白表達(dá)、cAMP水平和PKA活性。U0126可抑制rIL-1α誘導(dǎo)的p-MEK1/2和p-ERK1/2的表達(dá)，降低rIL-1α誘導(dǎo)的Gi蛋白表達(dá)、cAMP水平和PKA活性。rIL-1α作用15min后，Ras和Raf表達(dá)水平開(kāi)始升高，作用30 min后，Gi表達(dá)水平開(kāi)始升高。U0126作用30 min后，p-MEK1/2表達(dá)下降，作用60 min后，cAMP水平和PKA活性開(kāi)始下降。 這些結(jié)果提示Ras

9、-MAPKs路徑的活化可以促進(jìn)G蛋白偶聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；抑制MAPKs級(jí)聯(lián)應(yīng)答能抑制G蛋白偶聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 4.G蛋白-AC-cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)Ras-MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響及作用交叉位點(diǎn)。Iso可促進(jìn)Gi蛋白表達(dá)，升高cAMP水平和PKA活性，但對(duì)Ras，Raf,p-MEK1/2和p-ERK1/2無(wú)明顯影響。Ami能抑NRas，Raf,p-MEK1/2和P-ERK1/2表達(dá)，升高cAMP水平和PKA活性，對(duì)Gi蛋白表達(dá)無(wú)影響。Ami

10、作用15 min時(shí)，開(kāi)始提高cAMP水平和PKA活性；作用30 min時(shí)，Ras表達(dá)開(kāi)始下降。 這些結(jié)果提示升高cAMP水平和PKA活性能夠抑制Ras-MAPKs級(jí)聯(lián)應(yīng)答；其作用交叉位點(diǎn)可能是通過(guò)PKA下調(diào)膜蛋白R(shí)as表達(dá)，而進(jìn)一步抑制Ras-MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 II.Pae對(duì)CIA大鼠FLS中G蛋白-AC-cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和Ras-MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)兩信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑聯(lián)系的調(diào)節(jié)及作用環(huán)節(jié)1.Pae抑制CIA大鼠炎癥反應(yīng)及

11、FLS中炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。Pae恢復(fù)CIA大鼠降低的體重，抑制足爪腫脹，減低AI，改善組織病理。Pae也明顯抑制FLS中IL-1的活性及TNF-α和PGE2的產(chǎn)生。 2.Pae對(duì)CIA大鼠FLS中G蛋白-AC-cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用。CIA大NFLS中Gi蛋白表達(dá)增加，cAMP水平和PKA活性下降。Pae體內(nèi)和體外可以抑制Gi蛋白的表達(dá)，恢復(fù)低下的cAMP水平和PKA活性。 3.Pae對(duì)CIA大鼠FLS中Ras-MAPKs信號(hào)

12、轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用。CIA大鼠FLS中Ras，Raf,p-MEK1/2和P-ERK1/2的表達(dá)增加。體內(nèi)和體外給予Pae后，Ras，Raf,p-MEK1/2和P-ERK1/2的表達(dá)明顯下降。 4.Pae調(diào)節(jié)CIA大鼠FLS中G蛋白-AC-cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)交叉聯(lián)系及作用環(huán)節(jié)。 結(jié)論： 1.CIA模型是RA的一個(gè)慢性、免疫性炎癥模型。該模型一直廣泛用于RA病理機(jī)制的研究和用于評(píng)價(jià)

13、抗關(guān)節(jié)炎藥物。 2.CIA大鼠FLS中，Ras-MAPKs和G蛋白-AC-cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)間存在交叉聯(lián)系。Ras-MAPKs路徑的活化可以促進(jìn)G蛋白偶聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)：抑制MAPKs級(jí)聯(lián)應(yīng)答能抑制G蛋白偶聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。升高cAMP水平和PKA活性能夠抑制Ras-MAPKs級(jí)聯(lián)應(yīng)答；關(guān)鍵作用交叉位點(diǎn)可能是通過(guò)PKA下調(diào)膜蛋白R(shí)as表達(dá)，而進(jìn)一步抑制Ras-MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 3.Pae對(duì)CIA大鼠有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。Pae可以

14、抑制CIA大鼠炎癥反應(yīng)及FLS中炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。4.Pae調(diào)節(jié)CIA大鼠FLS中G蛋白-AC-cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制Gi蛋白的表達(dá)，升高cAMP水平，增強(qiáng)PKA活性；Pae調(diào)節(jié)CIA大鼠FLS中Ras-MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制Ras-MAPKs級(jí)聯(lián)活化；Pae調(diào)節(jié)G蛋白-AC-cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和Ras-MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的交叉聯(lián)系，其作用環(huán)節(jié)可能是Pae通過(guò)抑制Gi蛋白表達(dá)，上調(diào)cAMP水平和PKA括性，進(jìn)一步抑制Ras-MAPKs信號(hào)