骨髓間充質(zhì)干細胞移植與粒細胞集落刺激因子干細胞動員治療慢性心力衰竭的對比研究.pdf

1、近年來冠心病、急性心肌梗塞（AMI）發(fā)病率在我國呈逐漸升高的趨勢，盡管對心梗的治療方法取得很大進步，但心梗后心室重構，最終發(fā)展為慢性心力衰竭（CHF）仍是目前國內(nèi)外研究的熱點[1]。心肌細胞損傷壞死后由膠原、纖維結締組織替代，壞死部位變薄延展導致心衰。隨著藥物治療、介入技術和外科治療水平的提高，心肌梗塞患者心功能不全的病程得到延緩，但在成功接受血運重建的心肌梗死患者中，仍有超過30％患者發(fā)生遠期左室重構，引發(fā)心力衰竭。慢性心衰患者預后不

2、良，因此對再生壞死心肌、提高患者生存率的研究已成為刻不容緩的任務。 大量的實驗證實，骨髓干細胞可以取代壞死的心肌細胞并建立新的血管來改善缺血心肌供血，從而明顯改善心功能，臨床研究較多的有骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMScs）移植[2]，以及采用粒細胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）進行骨髓干細胞動員

3、[3]兩種方法。 骨髓干細胞是未分化的前體細胞，可以分化為多種細胞，包括心肌細胞，動物實驗研究表明，BMMSCs自體移植通過修復壞死心肌達到改善心臟功能的目的[4，5]。 目前研究表明，G-CSF能動員骨髓干細胞遷移至梗死部位，參與壞死心肌修復[6，7]。Orlic等[8]對大鼠的研究表明，G-CSF動員的骨髓干細胞除能分化為血管內(nèi)皮細胞外，還能分化為心肌細胞、平滑肌細胞。但Norol等[9]對狒狒心梗后使用G-CSF治

4、療，只是在梗死區(qū)發(fā)現(xiàn)有內(nèi)皮細胞，沒有發(fā)現(xiàn)新分化的心肌細胞。另外，G-CSF能增加梗死區(qū)巨噬細胞浸潤，加速壞死組織的吸收，減少肉芽組織和瘢痕的形成，從而促進梗死區(qū)的愈合過程[10]。 可以認為G-CSF骨髓干細胞動員與BMMSCs移植治療心肌梗死，其有效的細胞成份基本相同，然而目前國內(nèi)外尚未有對這兩種方法治療心肌梗死后慢性心衰的效果進行比較的報道。本研究目的在于觀察BMMSCs移植治療心肌梗死后慢性心力衰竭療效的同時，研究其可能機

5、制，并對BMMSCs移植和G-CSF骨髓干細胞動員這兩種方法進行比較，從而探討更有效、更適合的干細胞治療心肌梗死后慢性心力衰竭的方法。 本研究分三部分：第一部分大鼠心肌梗死后慢性心力衰竭模型的制作；第二部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、擴增和純化；第三部分骨髓間充質(zhì)干細胞移植與干細胞動員治療慢性心衰模型的對比研究。 第一部分大鼠心肌梗死后慢性心力衰竭模型的制作 目的:為研究干細胞移植在治療心衰中的價值，本研究目的在

6、于建立大鼠心肌梗死后心力衰竭模型，完善制作方法，并進行評估，深入心衰機制的研究。 方法:Wistar大鼠在左冠狀動脈前降支（LAD）起始部2～3mm處結扎，造成左心室大面積心肌梗死，建立心梗后慢性心力衰竭模型。觀察術后大鼠表現(xiàn)、心電圖變化。在模型建立前和建立后8周進行連續(xù)超聲檢查，超聲心動圖檢查儀使用SONOS7500型超聲診斷儀，心臟探頭頻率為10MHz。用二維切面超聲，選取大鼠左室長軸、短軸和心尖四腔心切面結合M型多普勒超聲

7、進行檢查，測量左室收縮末內(nèi)徑（LVDs）、左室舒張末內(nèi)徑（LVDd）、左室收縮末前壁厚度（LVATs）、左室舒張末前壁厚度（LVATd）、收縮末室間隔厚度（IVSTs）、舒張末室間隔厚度（IVSTd）、短軸縮短率（FS）、左室射血分數(shù)（LVEF）等指標，連續(xù)測量3次取均值；進行血流動力學檢查，檢測心率（HR）、左室收縮壓（LVSP）、左室舒張術壓（LVEDP）、計算左室壓力最大上升速率（+dp/dtmax）和左室壓力最大下降速率（-dp

8、/dtmax），并與術前和同期的對照組比較。術后8周處死，對心臟進行病理組織學檢查，判斷心梗區(qū)域大小。 結論:心梗后8周形成心衰模型，通過術中術后采取必要的措施，可以提高動物生存率。此方法有效且重復性好，可較理想地模擬心梗后慢性充血性心力衰竭的發(fā)生，對研究探討慢性心衰機制有重要意義。 第二部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、擴增和純化 目的建立一種簡便、快速、實用的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMMSCs）體外分離、純化和

9、擴增的方法，觀察其生長狀況、形態(tài)學特征和生物學特性，為慢性心力衰竭模型進行干細胞移植提供種子細胞。 方法采用密度梯度離心法對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的提取、分離、培養(yǎng)和體外擴增，用離心的方法分離出大白鼠的股骨骨髓，淋巴細胞分離液分離單個核細胞，經(jīng)沖洗后，培養(yǎng)、傳代，得到第三代骨髓間充質(zhì)干細胞（P3），于培養(yǎng)液中加入終濃度為50ug/ml的4，6二乙?；?2-苯基吲哚（DAPI），孵育，然后用Hanks平衡鹽液洗去未結合的DAPI。利

10、用熒光顯微鏡觀察計數(shù)同一個視野胞核發(fā)出藍色熒光的細胞數(shù)目，每個標本隨機計數(shù)10個高倍視野取其平均值，計算二者的比值即得到DAPI的標記率。 結論:經(jīng)密度梯度離心法得到的骨髓干細胞內(nèi)含有較多的BMMSCs，利用貼壁培養(yǎng)傳代方法成功對BMMSCs進行分離、培養(yǎng)、擴增和純化，細胞活力好。增殖能力強。DAPI標記BMMSCs敏感性好，標記效率高，可作為標記細胞的一種有效手段，BMMSCs體外培養(yǎng)成功為治療慢性心力衰竭提供了種子細胞。

11、 第三部分 骨髓間充質(zhì)干細胞移植與干細胞動員治療慢性心衰模型的對比研究 目的:骨髓間充質(zhì)干細胞移植與粒細胞集落刺激因子（G-CSF）動員自體骨髓來源的干細胞對大鼠心梗后慢性心力衰竭的治療作用進行比較，探討更有效、更適用的干細胞治療心梗后慢性心衰的方法。 方法:建立Wistar大鼠左冠狀動脈結扎方法復制心肌梗死后心衰模型，隨機分為干細胞移植組、干細胞動員組和對照組。移植組（n=10）模型建立后再次開胸，于梗死區(qū)

12、內(nèi)注射經(jīng)4，6-二乙?；?2-苯基吲哚（DAPI）標記后的骨髓間充質(zhì)干細胞，將細胞移植至梗死區(qū)。動員組（n=10）模型建立后開始皮下注射粒細胞集落刺激因子（G-CSF）30μg/kg·d，連續(xù)使用5天，對照組（n=10）不采取任何治療措施。4周后采用超聲心動圖檢查心臟功能變化，用多道生理記錄儀做血液動力學測定，描記左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室等容收縮/舒張期壓力上升或下降最大速率（±LVdp/dtmax）以反