乙酰化酶基因的RNA干擾文庫構(gòu)建、篩選及對HBV復(fù)制的影響.pdf

1、背景與目的:
　　cccDNA是肝細(xì)胞內(nèi)pgRNA/mRNA的轉(zhuǎn)錄模板及HBV感染慢性化的重要標(biāo)志物，在宿主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性與染色體結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。表觀遺傳學(xué)修飾直接參與染色體結(jié)構(gòu)的形成和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。有研究表明組蛋白乙?；揎椗cHBV復(fù)制相關(guān)。本課題對乙?；富蛘{(diào)控HBV cccDNA的轉(zhuǎn)錄和HBV復(fù)制的作用進(jìn)行研究，探索影響HBV復(fù)制的關(guān)鍵基因，對尋找新的慢性乙型肝炎抗病毒治療藥物靶點(diǎn)具有重要意義。
　　方法:
　　1

2、.構(gòu)建人類乙?；富蚵《綬NAi文庫，針對每個(gè)基因選擇8對保證干擾效率的shRNA序列(A-H)，構(gòu)建慢病毒載體。
　　2.A-D、E-H質(zhì)?；旌?，分別包裝，因此每個(gè)基因含有2個(gè)病毒混合液，每個(gè)混合病毒包含4對shRNA序列。shRNA慢病毒混合液感染HepG2.2.15細(xì)胞，感染后72h，收取RNA樣品，qPCR檢測HBV pgRNA。收集感染HepG2.2.15細(xì)胞96小時(shí)后的上清液，ELISA檢測細(xì)胞上清HBsAg的水平

3、。根據(jù)qPCR和ELISA/MTS結(jié)果確定影響HBV復(fù)制的乙?；富?。
　　3.將確定的陽性基因shRNA片段單獨(dú)包裝慢病毒，ELISA/MTS篩選能抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBV分泌的shRNA片段。
　　4.沉默陽性基因后，qPCR檢測pgRNA的表達(dá)水平;基因沉默72小時(shí)和96小時(shí)后，CMIA檢測Hep G2.2.15細(xì)胞上清分泌的HB sAg、 HBeAg含量，qPCR檢測HBV DNA的含量。
　　結(jié)果

4、:
　　1.篩選到16個(gè)乙?；富颍瑯?gòu)建128個(gè)慢病毒載體RNAi文庫。基因沉默后綜合qPCR及ELISA/MTS結(jié)果得到8個(gè)潛在陽性基因及有效shRNA混合序列:CREBBP、EP300、EPC1、HAT1、KAT5、ESCO1、CSRP2BP、KAT8。
　　2.8個(gè)基因單獨(dú)包裝后的36個(gè)慢病毒載體分別感染細(xì)胞，綜合qPCR和ELIS A/M TS結(jié)果發(fā)現(xiàn)HAT1、CSRP2BP和KAT8有2個(gè)以上的shRNA有效片段

5、，這些片段的抑制效果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對存在有效shRNA片段的基因的干擾效率用熒光定量PCR鑒定，除EPC1，其他基因5個(gè)shRNA序列均能沉默目的基因。
　　3.沉默HAT1、CSRP2BP和KAT8三個(gè)基因后qPCR檢測pgRNA表達(dá)明顯下降，HBsAg、 HBeAg和HBVDNA表達(dá)隨時(shí)間增加而下調(diào)，KAT8無論對HBsAg和HBeAg的抑制都非常明顯。
　　結(jié)論:
　　對16個(gè)乙酰化酶基因篩選和陽性基因有效sh