注射用重組人CTLA4-抗體融合蛋白在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、【背景】
　　注射用重組人CTLA4-抗體融合蛋白(rhCTLA4-Ig）是目前世界上第一個(gè)選擇性共刺激調(diào)節(jié)劑，它通過(guò)與CD80和CD86結(jié)合，阻斷CD28與之結(jié)合，從而抑制T淋巴細(xì)胞激活；CD28與CD80和CD86的相互作用，為T淋巴細(xì)胞的完全激活提供必要的共刺激信號(hào)。T淋巴細(xì)胞的激活與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的病理進(jìn)程相關(guān)，在RA患者的關(guān)節(jié)滑液中可以找到激活的T淋巴細(xì)胞。本藥適用于治療一種或一種以上改善病情的抗風(fēng)濕藥（DMARD

2、s）治療無(wú)效的中、重度活動(dòng)性RA的成年患者，可以減輕RA患者的臨床癥狀、延緩關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)損傷，并改善其生理功能。RhCTLA4-Ig是采用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的，是由一種人細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA4）胞外區(qū)和人免疫球蛋白G1（IgG1）修飾的Fc片段（鉸鏈區(qū)、CH2和CH3）相連接的融合蛋白。根據(jù)我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）通過(guò)《藥品注冊(cè)管理辦法》中界定的生物制品分類，rhCTLA4-Ig屬于治療用生物制品第7類新藥，其同

3、類產(chǎn)品在國(guó)外已經(jīng)上市銷售[1]，但在國(guó)內(nèi)尚無(wú)此類藥物。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)完成了rhCTLA4-IgI期臨床健康人體耐受性[2]和健康人體藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)[3]，為進(jìn)一步考察本藥物在RA患者體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)規(guī)律、了解該藥物多次給藥后藥代動(dòng)力學(xué)改變過(guò)程，是否在RA患者體內(nèi)發(fā)生改變、是否存在藥物蓄積作用等。因此我們進(jìn)行rhCTLA4-Ig在RA患者體內(nèi)多次給藥藥代動(dòng)力學(xué)研究。
　　【目的】
　　建立酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定RA患

4、者體內(nèi)血清中rhCTLA4-Ig濃度的方法；進(jìn)行多次靜脈滴注rhCTLA4-Ig在RA患者體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究；比較健康志愿者與RA患者藥物代謝動(dòng)力學(xué)規(guī)律以及臨床初步療效；為指導(dǎo)臨床制定安全、合理的用藥方案提供理論依據(jù)，為新藥審批和臨床用藥提供試驗(yàn)依據(jù)，也為Ⅱ期臨床研究提供參考依據(jù)。
　　【方法】
　　本研究共分三部分。
　　第一部分建立特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度良好ELISA法測(cè)定RA患者血清中rhCTLA4

5、-Ig濃度分析方法學(xué)；通過(guò)對(duì)方法特異性、精密度和準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性、線性范圍以及定量檢測(cè)限等效能指標(biāo)的考核并對(duì)方法學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)。用稀釋液將待檢測(cè)樣品稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量檢測(cè)范圍，即用稀釋液將待測(cè)樣品以2倍序列稀釋至200μg·L-1到3.125μg·L-1；將配備的酶標(biāo)板已預(yù)先用鼠抗人sCTLA4單抗包被好；測(cè)定前先用洗滌液清洗3次，然后加入標(biāo)準(zhǔn)品/待檢樣品與生物素標(biāo)記二抗，孵育2h，洗滌3次；加入HRP-親和素，孵育1h后，洗板3次，加入T

6、MB顯色溶液，避光顯色10min后終止，以450nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，630nm為參比波長(zhǎng)測(cè)定光密度值。以濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，光吸收值對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，用回歸的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清樣品里藥物的濃度，經(jīng)稀釋倍數(shù)校正后求得血清的最終濃度。
　　第二部分研究多次靜脈滴注10mg·Kg-1rhCTLA4-Ig在RA患者體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特征。本試驗(yàn)經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)、第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院倫理委員會(huì)成員一致通過(guò)，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格入選

7、確定9例RA患者進(jìn)行試驗(yàn)，在試驗(yàn)開始前均自愿簽屬知情同意書。按試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，受試者均符合美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)1987年提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]確診為RA患者；采用國(guó)外已上市產(chǎn)品Orencia臨床給藥方案[1]，于第0，2，4，8，12，16周靜脈滴注10mg·kg-1CTLA4-Ig，輸液在60±5分鐘內(nèi)完成，并在每次靜脈滴注前和靜脈滴注結(jié)束后即刻，并在最后一次滴注前和滴注后第0、2、4、12、24h、2、3、4、7、14、28、42、56、70

8、和84天取血2mL，置于預(yù)先已經(jīng)貼好標(biāo)簽并無(wú)菌干燥試管內(nèi)，2200×g離心分離血清，置-80℃保存待測(cè)。試驗(yàn)中隨時(shí)觀察受試者癥狀、體征以及各種不良反應(yīng)，并定期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查：血尿常規(guī)、肝腎功能、血液生化及血液電解質(zhì)變化等，綜合評(píng)價(jià)rhCTLA4-Ig在RA患者體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征，整個(gè)試驗(yàn)期間配備有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師和護(hù)士監(jiān)護(hù)。采用ELISA法測(cè)定血清中rhCTLA4-Ig的濃度，Tmax、Cmax采用實(shí)測(cè)值，AUC用統(tǒng)計(jì)矩方法計(jì)算，采用DAS2.

9、1軟件計(jì)算主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，所有計(jì)量資料均采用Excel或SPSS軟件進(jìn)行計(jì)算，以?X±SD表示，并進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差分析。
　　第三部分RA患者多次給藥后藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與同等劑量健康志愿者單次給藥藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較；評(píng)價(jià)RA患者的初步臨床療效。將RA患者多次給藥后藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與健康志愿者單次給藥藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較；RA患者試驗(yàn)前后關(guān)節(jié)疼痛個(gè)數(shù)及免疫學(xué)指標(biāo)進(jìn)行比較，均采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，研究其規(guī)律和差異。為指導(dǎo)臨床制定安全

10、、合理的用藥方案提供理論依據(jù)，為新藥審批和臨床用藥提供試驗(yàn)依據(jù)，并為Ⅱ期臨床研究提供參考依據(jù)。
　　【結(jié)果】
　　1.本試驗(yàn)采用ELISA法測(cè)定RA患者血清中rhCTLA4-Ig的濃度，最低定量限6.25μg·L-1，檢測(cè)濃度范圍3.125～200μg·L-1，在6.25～100μg·L-1范圍內(nèi)重現(xiàn)性良好，準(zhǔn)確度在100.4～112.1％之間，精密度RSD％在0.73～4.6％之間，各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到藥代動(dòng)力學(xué)研究的要求。

11、r>　　2.入選10例RA患者，男3例，女7例；其中因右束枝傳導(dǎo)阻滯剔除1例；給藥結(jié)束后觀察期因受試者自身原因脫落1例，全部受試者均無(wú)嚴(yán)重不良事件脫落。試驗(yàn)期間，受試者連續(xù)多次靜脈滴注本藥物后均未有嚴(yán)重不良事件發(fā)生；呼吸、心率、血壓、脈搏、體溫等生命體征未見(jiàn)異常；心電圖、胸片前后均正常。試驗(yàn)期間進(jìn)行血液生化指標(biāo)、尿常規(guī)、電解質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)，每次與試驗(yàn)前比較未發(fā)現(xiàn)有臨床意義上的改變，檢查結(jié)果雖然有陽(yáng)性指標(biāo)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析t檢驗(yàn)，p>0.05，無(wú)臨

12、床意義。注射藥物局部未發(fā)現(xiàn)皮膚紅腫、瘀斑或皮疹等刺激性反應(yīng)。試驗(yàn)觀察期間出現(xiàn)輕度不適反應(yīng)：顏面潮紅2例、瞬間眩暈1例、視力下降1例、口干1例，均未使用其它藥物自行痊愈。
　　3.RA患者于第0，2，4，8，12，16周連續(xù)靜脈滴注CTLA4-Ig10mg·kg-1，隨著給藥次數(shù)增加，血藥濃度不斷增加，到第8周時(shí)基本達(dá)到穩(wěn)態(tài)水平。達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)基本藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為：最后一次測(cè)得穩(wěn)態(tài)時(shí)峰濃度Cssmax為247.1±50.34mg·L-1，穩(wěn)

13、態(tài)時(shí)谷濃度Cssmin為19.7±9.5mg·L-1，平均穩(wěn)態(tài)濃度Css?av為63.4±25.mg·L-1，AUCss為1830±708mg·d·L-1，波動(dòng)系數(shù)DF為3.48±1.61。達(dá)到穩(wěn)態(tài)后基本藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為：達(dá)峰時(shí)間Tmax為0.063±0.039d，峰濃度Cmax為247.1±50.3mg·L-1，t1/2為12.6±4.7d，AUC(0-t)為2347±901mg·d·L-1，AUC(0-∞)為2362±906mg·d·L

14、-1，清除率CL為0.0050±0.0023L·d·kg-1，表觀分布容積Vss為0.074±0.031L·kg-1。
　　4.比較RA患者和健康志愿者的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，RA患者的半衰期t1/2為12.6±4.7d，健康志愿者為14.2±2.3d，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（p>0.05）。RA患者清除率CL為0.0050±0.0023L·d·kg-1，健康志愿者為0.0067±0.0010L·d·kg-1（p>0.05）。RA患者表觀分布容

15、積Vss明顯比健康人小，為0.074±0.031L·kg-1，而健康者為0.138±0.033L·kg-1。根據(jù)美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)判，第3次給藥后，給藥前和給藥后的臨床癥狀有所改善，關(guān)節(jié)改善達(dá)到20％（ADR20）為78％，ACR50有效率分別為11％。第6次給藥后臨床癥狀進(jìn)一步改善，ADR20有效率分別為100％，ACR50有效率分別為78％。試驗(yàn)期間進(jìn)行免疫學(xué)指標(biāo)血沉、C反應(yīng)蛋白、類風(fēng)濕因子指標(biāo)檢測(cè)，均與試驗(yàn)前比較，結(jié)果

16、顯示各項(xiàng)指標(biāo)均有所下降。血沉平均降低16.67±19.83mm·L-1；C反應(yīng)蛋白平均降低204.41±300.91IU·mL-1；類風(fēng)濕因子平均降低1.55±2.30mg·L-1，但經(jīng)t檢驗(yàn)，p>0.05，無(wú)臨床意義。
　　【結(jié)論】
　　1.ELISA分析方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度良好的特點(diǎn)。高、中、低三種濃度的質(zhì)量控制樣品在盒內(nèi)、盒間精密度的變異均小于10％，符合生物樣品分析要求；三種濃度的質(zhì)控樣品分別置

17、于426℃小時(shí)，室溫20小時(shí)，-809℃?zhèn)€月穩(wěn)定性良好，表明該方法適合定量分析測(cè)定RA患者體內(nèi)血清中rhCTLA4-Ig濃度，全部指標(biāo)均符合2005年版的《中國(guó)藥典》以及SFDA頒布的《化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》關(guān)于進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究的試驗(yàn)要求。
　　2.RA患者多次靜脈滴注rhCTLA4-Ig后，RA患者連續(xù)6次靜脈滴注rhCTLA4-Ig10mg·kg-1后，隨著給藥次數(shù)增加血藥濃度不斷增加，到第4次基本達(dá)到穩(wěn)態(tài)水平

18、；每次給藥后血藥濃度迅速達(dá)到峰值，但消除緩慢，在體內(nèi)不存在蓄積現(xiàn)象。本研究得到的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道基本相同。對(duì)肝、腎功能、血常規(guī)、尿常規(guī)和血液生化檢查均無(wú)明顯影響，安全性良好。因此我們推薦治療國(guó)人RA患者，rhCTLA4-Ig的給藥劑量為10mg·Kg-1，給藥方式為靜脈滴注，于wK0、2、4給藥一次，以后每4wK給藥1次，該方案在臨床推廣使用。建議臨床按此方案用藥時(shí)，使用時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，以減少藥物不良反應(yīng)。
　　3.