草魚細(xì)胞色素P4503A和孕烷X受體基因表達(dá)分析及其功能初步研究.pdf

1、細(xì)胞色素P450(CYP)是動(dòng)物體內(nèi)代謝藥物的重要酶系，其亞型細(xì)胞色素P4503A(CYP3A)是動(dòng)物肝臟、小腸和腎臟中含量最多的P450酶系，參與大多數(shù)藥物的生物轉(zhuǎn)化，且CYP3A能被藥物誘導(dǎo)或者抑制。孕烷X受體(PXR)屬于核受體超家族(NR)的NR1Ⅰ家族，其作為藥物代謝的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與CYP3A的誘導(dǎo)表達(dá)。關(guān)于魚類CYP3A表達(dá)穩(wěn)定階段研究，CYP3A經(jīng)由其轉(zhuǎn)錄因子PXR調(diào)控共同參與藥物代謝研究報(bào)道甚少。
　　本文

2、首先通過(guò)生物化學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，先對(duì)CYP3A基因進(jìn)行克隆并分析其結(jié)構(gòu)功能域，檢測(cè)其組織中表達(dá)豐度;再克隆了CYP3A轉(zhuǎn)錄因子PXR基因部分序列，檢測(cè)其組織中表達(dá)豐度。其次，研究在草魚體外最佳誘導(dǎo)模型中，CYP3A在mRNA和酶活性水平與時(shí)間動(dòng)態(tài)變化的相關(guān)性，確定了CYP3A在草魚中穩(wěn)定表達(dá)階段。在藥物處理?xiàng)l件下，對(duì)PXR基因與CYP3A表達(dá)量差異進(jìn)行研究，分析了CYP3A酶活性-CYP3A mRNA-PXR mRNA三者間相

3、關(guān)性。用初步建立的誘導(dǎo)平臺(tái)，氧氟沙星(OFLX)作為CYP3A的底物和誘導(dǎo)劑，驗(yàn)證CYP3A參與OFLX代謝過(guò)程中，其穩(wěn)定表達(dá)階段及其CYP3A酶活性-CYP3AmRNA-PXR mRNA三者間相關(guān)性。全文主要研究結(jié)果如下:
　　一.草魚CYP3A基因克隆、序列分析及mRNA表達(dá)差異
　　根據(jù)GenBank中斑馬魚和虹鱒的CYP3A基因序列，設(shè)計(jì)保守區(qū)域的簡(jiǎn)并引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲取CYP3A基因部分保守序列。根據(jù)CYP3A

4、已獲序列再設(shè)計(jì)引物，獲取開放閱讀框，然后，采用3' RACE法獲取CYP3A序列末端;設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，用SYBR熒光染料檢測(cè)CYP3A mRNA組織表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:(1)本研究得到草魚CYP3A部分cDNA核苷酸序列為1849bp，包含保守編碼區(qū)、3'UTR序列。開放閱讀框序列長(zhǎng)1542bp，編碼513個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼(TAA)，編碼區(qū)包括信號(hào)肽(29aa)。(2)分析草魚CYP3A主要結(jié)構(gòu)域，其包含3個(gè)跨膜螺旋區(qū)

5、，9個(gè)磷酸化位點(diǎn)，6個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)、1個(gè)血紅素蛋白結(jié)合區(qū)和含1個(gè)半胱氨酸(Cys，C—448aa)的亞鐵-血紅素配體結(jié)合位點(diǎn)。(3)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)草魚9種組織CYP3A mRNA相對(duì)含量，其表達(dá)豐度依次如下:前腸＞肝臟＞腎臟＞鰓＞肌肉＞后腸＞性腺＞心臟＞脾臟。其中，前腸、肝臟和腎臟是其主要表達(dá)部位，而其他各組織表達(dá)量較弱。藥物代謝酶亞型在組織中的分布與其參與藥物代謝的主要部位相關(guān)。
　　二.草魚PXR

6、基因克隆、序列分析及mRNA表達(dá)差異
　　根據(jù)GenBank中斑馬魚和虹鱒魚類的PXR基因序列，設(shè)計(jì)保守區(qū)域的簡(jiǎn)并引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲取PXR基因部分保守序列。設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，用SYBR熒光染料檢測(cè)PXR mRNA組織表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:(1)本研究得到草魚PXR部分cDNA核苷酸序列為509bp和推導(dǎo)169aa序列。(2)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)9種組織PXR mRNA相對(duì)含量，其表達(dá)豐度依次如

7、下:前腸＞肝臟＞腎臟＞鰓＞肌肉＞后腸＞性腺＞心臟＞脾臟。其中，前腸、肝臟和腎臟是其主要表達(dá)部位，而其他各組織表達(dá)量較弱。根據(jù)結(jié)果顯示PXR與CYP3A基因在魚體組織中表達(dá)部位基本一致。
　　三.利福平和氧氟沙星對(duì)草魚腎細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)
　　細(xì)胞的傳代培養(yǎng)、凍存與復(fù)蘇采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法。細(xì)胞中蛋白含量檢測(cè)采用BCA法。采用MTT法分析了利福平在濃度為10-、20-、40和80μM，孵育時(shí)間為1-、2-、4-、6-、8-、10-、

8、12-、24-、48-和72 h;氧氟沙星在濃度分別為25-、50-、100-、200-、400和800μM，對(duì)草魚腎細(xì)胞作用1-、2-、4-、6-、8-、10-、12-、24和48 h之后，其結(jié)果表明孵育48h后，細(xì)胞活率下降，因此，腎細(xì)胞中選擇RIF濃度為40μM和細(xì)胞孵育時(shí)間為1～24 h，也可作為最佳誘導(dǎo)模型進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);OFLX選擇50μM和細(xì)胞孵育時(shí)間為1～24 h作為最佳條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，能對(duì)后續(xù)研究利福平和氧氟沙星在腎細(xì)

9、胞中最佳代謝時(shí)間和濃度提供依據(jù)。
　　四.最佳誘導(dǎo)模型CYP3A基因轉(zhuǎn)錄和酶活性檢測(cè)
　　為了確定CYP3A在草魚腎細(xì)胞中主要誘導(dǎo)及穩(wěn)定表達(dá)階段，本研究從CYP3A基因轉(zhuǎn)錄水平和酶活表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定并評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)中使用CYP3A指示酶紅霉素-N-脫甲基酶(ERND)，采用分光光度計(jì)法檢測(cè)CYP3A酶活性;設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，采用SYBR熒光染料檢測(cè)CYP3A mRNA表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:CYP3A轉(zhuǎn)錄水平在2h誘導(dǎo)量提

10、高，而酶活性則在4h開始升高，兩種水平間具有時(shí)間差異性，而CYP3A轉(zhuǎn)錄水平先于酶活2h表達(dá);RIF對(duì)CYP3A轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)效應(yīng)顯著強(qiáng)于酶活性水平誘導(dǎo)，這很可能反映了RIF誘導(dǎo)CYP3A表達(dá)是作用于轉(zhuǎn)錄水平的基因調(diào)控來(lái)影響酶活性。
　　五.CYP3A與PXR mRNA表達(dá)及CYP3A酶活性三者相關(guān)性
　　RIF誘導(dǎo)后，CYP3A轉(zhuǎn)錄水平在2h被誘導(dǎo)基因上調(diào)，而PXR則至10h開始上調(diào)，此結(jié)果顯示出CYP3A和PXR的基因轉(zhuǎn)錄

11、水平上調(diào)呈現(xiàn)時(shí)間先后順序。推斷出PXR與藥物結(jié)合后，受到藥物刺激經(jīng)時(shí)間發(fā)生反應(yīng)，再參與后續(xù)的-系列作用;也顯示出RIF與PXR結(jié)合后能激活PXR，并經(jīng)由PXR這一轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與激活并誘導(dǎo)CYP3A mRNA表達(dá)，不直接作用于翻譯后酶活性，CYP3A酶活性主要是通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)而達(dá)到活性增強(qiáng)的效果。
　　六.氧氟沙星對(duì)CYP3A和PXR基因表達(dá)和酶活性影響
　　氧氟沙星(OFLX)孵育CIK，研究其時(shí)間動(dòng)態(tài)過(guò)程中CYP3A與

12、PXR量變相關(guān)性。用分光光度法測(cè)定CYP3A酶活性，用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CYP3A和PXR基因表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:(1) CYP3A酶活性在氧氟沙星處理后4h開始提高，達(dá)致平臺(tái)期后處于穩(wěn)定階段，而CYP3A mRNA在孵育10h后開始開始上調(diào)。(2)PXR mRNA基底水平表達(dá)量較低，在OFLX孵育6～8 h后，逐漸上調(diào)，其mRNA開始上調(diào)時(shí)間先于CYP3A mRNA發(fā)生。由此推斷整個(gè)藥物代謝過(guò)程首先是OFLX經(jīng)與PXR結(jié)合，然后其結(jié)