宮頸癌Hela細(xì)胞輻射后加速增殖的相關(guān)研究.pdf

1、宮頸癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，放射治療是治療中晚期宮頸癌的一種非常重要的方法，宮頸癌5年生存率近20年沒(méi)有明顯的改變，總生存率在50％左右。目前我們常用的經(jīng)典方法就是以DT2Gy/天，DT10Gy/周的常規(guī)分割放射治療。然而實(shí)踐證明此方法并非對(duì)任何來(lái)源，任何時(shí)期的腫瘤都是最佳方法。因此人們努力的尋找各種更有效的方法，其中改變時(shí)間劑量因素是提高療效的重要研究途徑之一。 非常規(guī)分割放療是放射腫瘤學(xué)家尋求到的一種新的放療方案，并已在

2、頭部鱗癌的臨床治療中取得良好的效果。受此啟發(fā)國(guó)外少數(shù)學(xué)者將此技術(shù)引入宮頸癌的治療，Kavanagh BD分別兩次報(bào)道兩個(gè)獨(dú)立小樣本研究結(jié)果，顯示在降低了毒副作用的基礎(chǔ)上，超分割技術(shù)和后程加速超分割技術(shù)對(duì)晚期宮頸癌局部控制和生存率高于用常規(guī)分割治療的病人。這一方法能提高腫瘤的局部控制，降低并發(fā)癥。 腫瘤放射治愈意味著腫瘤干細(xì)胞喪失無(wú)限增殖能力。但是近幾年放射生物學(xué)研究表明，在放射過(guò)程中腫瘤干細(xì)胞能補(bǔ)償性的加速再增殖，使控制腫瘤的等

3、效劑量發(fā)生變化。腫瘤干細(xì)胞的加速再增殖是常規(guī)放療失敗的原因之一。目前檢測(cè)細(xì)胞放射后是否出現(xiàn)加速增殖的直接指標(biāo)就是其克隆源性細(xì)胞的增殖能力，間接可以通過(guò)腫瘤細(xì)胞潛在性倍增時(shí)間(Potential doubling time，Tpot)的變化來(lái)確定。本試驗(yàn)就是立志于檢測(cè)宮頸癌Hela細(xì)胞被照射后否存在加速增殖，以及加速增殖出現(xiàn)的時(shí)間和部分與增殖有關(guān)的基因的表達(dá)水平的變化。為達(dá)到此檢驗(yàn)?zāi)康摹Ｊ紫任覀冞€要初步了解Hela細(xì)胞在我院各方面試驗(yàn)條件

4、下，其細(xì)胞輻射敏感性以及輻射動(dòng)力學(xué)基線(xiàn)的各項(xiàng)變化指標(biāo)，尋找輻射敏感劑量點(diǎn)和增殖敏感時(shí)間點(diǎn)，為后續(xù)的各項(xiàng)試驗(yàn)做好準(zhǔn)備。 應(yīng)用MTT法檢分別測(cè)照射組(2，4，6，8Gy四個(gè)放射劑量)單次照射與對(duì)照組(OGy組)作用下HELA細(xì)胞在隨后的24h及6天內(nèi)的生長(zhǎng)活力和增殖動(dòng)力學(xué)變化趨勢(shì)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，為后續(xù)試驗(yàn)選擇相對(duì)的輻射敏感檢測(cè)點(diǎn)及輻射敏感劑量點(diǎn)。結(jié)果顯示在不同劑量照射下Hela細(xì)胞的增殖變化趨勢(shì)不盡相同，照射計(jì)量越大最終對(duì)細(xì)胞的損

5、傷就越大。24小時(shí)內(nèi)相對(duì)在3～6小時(shí)的時(shí)間段中Hela細(xì)胞的增殖速度最快，屬于增殖敏感階段。6天內(nèi)對(duì)照(OGy)組與2Gy組生長(zhǎng)變化無(wú)差異(P>0.05)。這些結(jié)果說(shuō)明我們要(1)選擇不同的照射組進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，并比較組間差異，了解Hela細(xì)胞與輻射劑量依存的關(guān)系。(2)可在3～6小時(shí)中選擇后續(xù)試驗(yàn)的敏感檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。(4)因2Gy組的Hela細(xì)胞6天生長(zhǎng)情況下與對(duì)照組無(wú)差異，在后續(xù)試驗(yàn)中可將2Gy刪除，余下4、6、8Gy組作為放射敏感劑量

6、點(diǎn)。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法，平板克隆形成試驗(yàn)以及流式細(xì)胞儀法檢不同輻射劑量下Hela細(xì)胞Tpot變化的情況、克隆形成情況、以及細(xì)胞增殖周期的變化，并推斷Hela細(xì)胞輻射后是否會(huì)出現(xiàn)加速增殖，出現(xiàn)加速增殖的時(shí)間。結(jié)果顯示不同劑量單次照射后Hela細(xì)胞。Tpot的縮短。并且單次放射劑量越大，后續(xù)Tpot就越小(P<0.01)，成計(jì)量依賴(lài)關(guān)系。輻射劑量越大細(xì)胞克隆形成率就越小(P<0.05)，進(jìn)而統(tǒng)計(jì)推斷其與Tpot有正相關(guān)性(P<0.05)。在檢測(cè)

7、起始兩天內(nèi)細(xì)胞周期表現(xiàn)為S期的輕微上調(diào)以及G2期的下調(diào)，而在后續(xù)時(shí)間中就出現(xiàn)了S期和G2期的共同下調(diào)。這些結(jié)果說(shuō)明(1)輻射后Hela細(xì)胞的確會(huì)出現(xiàn)加速增殖，加速增殖出現(xiàn)于輻射后的早期階段約在第一天～第三天之間，結(jié)束時(shí)間目前不明。(2)細(xì)胞的增殖速度決定于腫瘤干細(xì)胞的增殖能力，試驗(yàn)中Tpot縮短對(duì)應(yīng)著克隆形成的減小，這說(shuō)明殘余的有增殖活力的腫瘤干細(xì)胞處于加速增殖的狀態(tài)。(3)細(xì)胞周期檢測(cè)早期階段有S期的上升表現(xiàn)為SPF及PI指標(biāo)的增高，

8、這樣說(shuō)明Hela細(xì)胞出現(xiàn)了加速增殖。在輻射后期S期和G2期細(xì)胞比率減少，說(shuō)明輻射對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷或誘導(dǎo)調(diào)亡的作用是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程，輻射后期大量細(xì)胞凋亡或死亡出現(xiàn)了周期的明顯變化。(4)S期和G2期細(xì)胞比率降低說(shuō)明輻射對(duì)細(xì)胞抑制發(fā)生在Gl-S期，S-G2期兩個(gè)檢驗(yàn)點(diǎn)中。 采用PT-PCR法，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)不同輻射劑量下，宮頸癌Hda細(xì)胞中與增殖有關(guān)的PCNA，Ki-67基因、蛋白的表達(dá)情況。從分子角度分析輻射都與Hda細(xì)胞增殖

9、動(dòng)力學(xué)的影響。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示于輻射后一、二天Hela細(xì)胞出現(xiàn)有PCNA、Ki-67的增高，把第一天的數(shù)據(jù)進(jìn)行組間比較析，可以看出在照射組和對(duì)照組之間的確是有差異的(P<0.05)。隨后表達(dá)開(kāi)始逐漸降低，8Gy組于照射檢測(cè)末期甚至測(cè)不到Ki-67的表達(dá)，而PCNA的表達(dá)也不足放射后第一天的一半。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示，細(xì)胞的確出現(xiàn)大量的放射性損傷，但在蛋白檢測(cè)中，Ki-67和PCNA在對(duì)照組和放射組之間的表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)．