Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠模型的制備、評(píng)價(jià)及部分機(jī)制的研究.pdf

1、目的：在雞胸骨劍突軟骨中提取、純化II型膠原蛋白(C II)并進(jìn)行初步鑒定，為制備膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠模型提供原材料；制備CIA大鼠模型，從形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)及病理組織學(xué)等多角度觀察CIA大鼠模型特點(diǎn)；進(jìn)一步闡明CIA大鼠的發(fā)病機(jī)制。 方法和結(jié)果：1.Ⅱ型膠原蛋白(coIIagen typeⅡ，CⅡ)的提取、純化與鑒定以雞胸骨劍突軟骨為原料，采用胃蛋白酶消化法在酸性條件下提取C II；運(yùn)用鹽酸胍抽提，NaCl的反復(fù)鹽析純

2、化，DEAE.52纖維樹脂處理，透析除鹽等方法去除蛋白多糖、CII降解片段及變性產(chǎn)物以純化CII；采用SDS-PAGE電泳和吸收光譜分析的方法鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所提取的C II與標(biāo)準(zhǔn)品分子量一致，最大吸收峰為226nm，證實(shí)所提取純化的蛋白為II型膠原。 2.膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠(coIIagen-induced arthritis，CIA)模型的制備及評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)室自提CII加完全弗氏佐劑(CFA)采用皮內(nèi)注射的方法建立大鼠CIA模

3、型。容積法檢測(cè)大鼠足爪腫脹度并進(jìn)行評(píng)分；HE染色法對(duì)關(guān)節(jié)組織作病理檢查；EL,ISA法檢測(cè)體內(nèi)抗C1I抗體的含量；放免法檢測(cè)血清細(xì)胞因子IL-1β,TNF-α含量。結(jié)果顯示，CIA大鼠足爪的炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈，關(guān)節(jié)腫脹明顯；病理檢查關(guān)節(jié)組織可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有組織纖維化；血清中抗C II抗體水平和IL.16、TNF-α顯著升高，提示膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠模型制備成功。 3.膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠部分機(jī)制的研究在CIA大鼠模型制備成功的基礎(chǔ)上，

4、用MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)；RT-PCR法檢測(cè)CIA大鼠脾組織調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性標(biāo)志物--Foxp3及其表面的TGF-β1的表達(dá)。結(jié)果顯示，CIA大鼠體內(nèi)脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)增強(qiáng)；Foxp3mRNA與TGF-β1 mRNA表達(dá)均降低。 結(jié)論：1.所提取純化的蛋白為II型膠原，該方法提純C II簡(jiǎn)單，高效。2.制備的CIA大鼠模型其臨床表現(xiàn)、免疫學(xué)及病理學(xué)改變均與人類RA相似，模型制備成功。3.在CIA模型中，淋巴細(xì)胞增減