Caveolin-1特異性siRNA對(duì)乳腺上皮細(xì)胞雌激素受體α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響.pdf

1、乳腺癌是一種常見的婦科腫瘤，近20年來在我國(guó)的發(fā)病率逐漸升高，已嚴(yán)重威脅女性的健康。乳腺癌的發(fā)生是一個(gè)多階段、多因素參與的過程。許多證據(jù)表明，雌激素刺激是乳腺癌發(fā)生的一個(gè)重要的致病因子。雌激素的活性主要是受雌激素受體(ER)的調(diào)節(jié)，雌激素受體是核受體家族的成員，并且作為配體激活型轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)雌激素應(yīng)答基因的表達(dá)水平。ERα有三種亞型：ERα-66，ERα-46和ERα-36。核內(nèi)的ERα-66的活化可以較大程度的影響17β-雌二醇(E2

2、)誘導(dǎo)的雌激素依賴性乳腺細(xì)胞的增殖。在正常乳腺上皮細(xì)胞中，ERα-66處于一個(gè)較低的表達(dá)水平，但是在向乳腺癌轉(zhuǎn)化的過程中，其表達(dá)水平發(fā)生明顯的上調(diào)。然而，在這一過程中，促使ERα-66表達(dá)發(fā)生明顯升高的分子機(jī)制尚不清楚。此外，另有研究表明ERα-66和ERα-46可以影響NO的合成。ERα-36是一種新型的ERα亞型，它作為一種膜受體，可以影響雌激素和抗雌激素引起的細(xì)胞增殖。ERα-36調(diào)節(jié)膜起始的雌激素和抗雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制已成

3、為近年來關(guān)注的熱點(diǎn)。 Caveolae是細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷形成的凹陷小窩，其標(biāo)志性蛋白——Caveolin-1(Cav-1)常作為腫瘤抑制因子行使多種細(xì)胞功能。值得關(guān)注的是，在ERα陽性乳腺癌中，常伴有Cav-1的顯性缺失突變。并有臨床研究表明，在Cav-1缺失的乳腺上皮細(xì)胞中，ERα的表達(dá)發(fā)生明顯上調(diào)?？梢?，Cav-1與ERα表達(dá)水平有著密切的關(guān)系。另有證據(jù)表明，在質(zhì)膜上也存在ERα-66的表達(dá)，并且其就定位在Caveolae上。在

4、乳腺癌(MCF-7)細(xì)胞中，Cav-1過表達(dá)可促使胞質(zhì)中的ER轉(zhuǎn)位到質(zhì)膜上。另外，早期研究表明，E2可以與膜上的受體結(jié)合并引發(fā)cAMP的快速產(chǎn)生。之后，又有研究表明，定位在質(zhì)膜上的雌激素受體可以誘導(dǎo)膜起始的雌激素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的發(fā)生。這一膜起始的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以激活許多胞質(zhì)內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白的表達(dá)及膜雌激素起始的信號(hào)通路的活化，主要包括腺苷酸環(huán)化酶，G蛋白偶聯(lián)受體，促有絲分裂原活化蛋白激酶和磷脂酰3激酶等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。作為腫瘤抑制

5、因子，在乳腺上皮細(xì)胞中，Cav-1表達(dá)下調(diào)對(duì)乳腺癌早期轉(zhuǎn)化和ER介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的深入研究。 本實(shí)驗(yàn)以利用基因捕獲技術(shù)獲得的Cav-1單倍不足細(xì)胞株(MCF10A-ST1，MCF 10A-ST3)和其母細(xì)胞株MCF 10A為研究對(duì)象，應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)Cav-1與ERα之間的相互作用關(guān)系，小RNA干擾技術(shù)沉默乳腺上皮細(xì)胞Cav-1表達(dá)，利用Western Blot檢測(cè)了ERα及其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)

6、蛋白的表達(dá)水平，探討Cav-1的表達(dá)水平與ER介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系及其可能的分子機(jī)制。旨在闡明Cav-1在人正常乳腺細(xì)胞早期轉(zhuǎn)化中的部分作用機(jī)制，為進(jìn)一步揭示乳腺癌發(fā)病機(jī)理提供直接的科學(xué)依據(jù)。 結(jié)果如下：(1)利用siRNA干擾技術(shù)，我們成功建立了Cav-1基因沉默細(xì)胞模型--7SD8；(2)在MCF 10A和ST3細(xì)胞中，Cav-1與ERα均具有相互作用關(guān)系，并且隨著Cav-1表達(dá)不斷下降，Cav-1與ERα之間的結(jié)合能力

7、越來越強(qiáng)；(3)在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MCF 10A細(xì)胞96小時(shí)后，Cav-1表達(dá)發(fā)生明顯降低，并且隨著Cav-1表達(dá)不斷下降，ERα-66的表達(dá)明顯升高，而ERα-36的表達(dá)卻是先下降后又重新升高；(4)在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ST1細(xì)胞時(shí)，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的不斷增加，Cav-1蛋白的表達(dá)水平不斷下降；(5)在Cav-1進(jìn)一步下降的過程中，磷酸化ERK蛋白的表達(dá)量在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ST1細(xì)胞48小時(shí)和72小時(shí)后發(fā)生明顯的增加，在96小時(shí)后又恢復(fù)正常，而總ERK1/2蛋白的

8、表達(dá)水平無明顯變化，并且在7SD8細(xì)胞株中我們同樣檢測(cè)到較高水平的磷酸化ERK1/2蛋白的表達(dá)：(6)磷酸化AKT蛋白的表達(dá)在轉(zhuǎn)染72小時(shí)后發(fā)生明顯上調(diào)，而總AKT蛋白的表達(dá)也在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后發(fā)生明顯上調(diào)，同時(shí)其上游分子P13K蛋白的表達(dá)在轉(zhuǎn)染48h和72h時(shí)也發(fā)生明顯上調(diào)，其下游分子P21蛋白的表達(dá)在轉(zhuǎn)染48小時(shí)和96小時(shí)后發(fā)生明顯降低。(7)在Cav-1表達(dá)短暫下調(diào)的過程中，細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1的表達(dá)水平并無明顯變化。